Elektroporation methode voor in vivo levering van plasmide DNA in de volwassen zebravis Telencephalon
Summary
Hier is een elektroporation methode voor plasmide DNA levering en ependymoglial cellabeling in de volwassen zebravis telencephalon. Dit protocol is een snelle en efficiënte methode om individuele ependymoglial cellen te visualiseren en te traceren en opent nieuwe mogelijkheden om elektroporation toe te passen op een breed scala aan genetische manipulaties.
Abstract
Elektroporation is een transfectie methode waarbij een elektrisch veld wordt toegepast op cellen om tijdelijke poriën in een celmembraan te creëren en de permeabiliteit ervan te vergroten, waardoor verschillende moleculen in de cel kunnen worden geïntroduceerd. In dit document wordt elektroporation gebruikt voor het introduceren van plasmiden aan ependymoglial cellen, die de ventriculaire zone van de volwassen zebravis telencephalon lijn. Een fractie van deze cellen toont stamcel eigenschappen en genereert nieuwe neuronen in de hersenen van de zebravis; Daarom is het bestuderen van hun gedrag essentieel om hun rol in neurogenese en regeneratie te bepalen. De introductie van plasmiden via electroporatie maakt lange termijn labeling en tracking van een enkele ependymoglial cel mogelijk. Bovendien kunnen plasmiden zoals CRE of of Cas9 worden geleverd aan enkelvoudige ependymoglial cellen, die genrecombinatie of genbewerking mogelijk maken en een unieke kans bieden om de autonome genfunctie van de cel te beoordelen in een gecontroleerde, natuurlijke Milieu. Ten slotte wordt dit gedetailleerde, stapsgewijze electroporatie protocol gebruikt om een succesvolle introductie van plasmiden tot een groot aantal enkelvoudige ependymoglial cellen te verkrijgen.
Introduction
Zebravis zijn uitstekende diermodellen om hersen regeneratie na een steekwond letsel te onderzoeken. In vergelijking met zoogdieren, op de evolutionaire ladder, minder geëvolueerde soorten zoals zebravis in het algemeen vertonen hogere tarieven van constitutieve neurogenese en bredere gebieden van volwassen neurale stamcellen residentie, wat leidt tot constante generatie van nieuwe neuronen in de hele de meeste hersengebieden in het volwassen leven. Deze functie lijkt te correleren met significant hogere regeneratieve capaciteit van zebravis in vergelijking met zoogdieren1, als zebravis hebben opmerkelijk potentieel om efficiënt te genereren nieuwe neuronen in de meeste hersenen letsel modellen bestudeerd2, 3,4,5,6,7,8. Hier wordt de zebravis telencephalon bestudeerd, omdat het een hersengebied is met prominente neurogenese in volwassenheid. Deze zones van volwassen neurogenese zijn homologe aan neurogene zones in de volwassen zoogdieren hersenen9,10,11.
Overvloedige neurogene gebieden in de zebravis telencephalon zijn aanwezig vanwege het bestaan van radiale glia zoals cellen of ependymoglia-cellen. Ependymoglial cellen fungeren als Resident volwassen neurale stamcellen en zijn verantwoordelijk voor het genereren van nieuwe neuronen in zowel de intact en regenereert hersenen3,5. Lineage tracing experimenten hebben aangetoond dat ventriculaire ependymoglia reageren op letsel, dan prolifereren en genereren van nieuwe neuroblasten die migreren naar de laesie site5. Door de gemuteerde aard van zebravis telencephalon lijnen de ependymogliale cellen het ventriculaire oppervlak en bouwen de ventrale ventriculaire wand. De dorsale ventriculaire wand wordt gevormd door een dorsale Ependymale cellaag (Figuur 1a). Belangrijker is dat zebravis ependymoglia de kenmerken van zowel de zoogdier radiaal glia als de Ependymale cellen belichaam. Lange radiale processen zijn een typisch kenmerk van radiale glia-cellen, terwijl cellulaire extensies en nauwe kruisingen (evenals hun ventriculaire posities) typische kenmerken zijn van Ependymale cellen12,13,14. Daarom worden deze cellen ependymoglial cellen genoemd.
Om in vivo gedrag van enkelvoudige ependymoglial cellen tijdens regeneratie te volgen, moeten ze op betrouwbare wijze worden gelabeld. Verschillende methoden van in vivo cellabeling voor fluorescerende microscopie zijn eerder beschreven, zoals endogene verslaggevers of lipofiele kleurstoffen15. Deze methoden, in tegenstelling tot elektroporation, kan vereisen langere tijd en vaak bieden niet de mogelijkheid van één cel labeling of permanente lange termijn tracering. Elektroporation, echter (naast het labelen van één cel), biedt de mogelijkheid om nieuw DNA in de host-cel te introduceren. Bovendien, in vergelijking met andere methoden van DNA-overdracht in de cellen, is elektroporation aangetoond dat het een van de meest efficiënte methoden16,17,18,19is.
Hier gepresenteerd is een electroporatie protocol dat is verfijnd met het oog op het labelen van enkele ependymoglial cellen in de volwassen zebravis telencephalon. Dit protocol voorziet in de etikettering van enkelvoudige ependymoglial cellen om ze gedurende een lange periode van20 te kunnen volgen of om specifieke trajecten op autonome wijze te manipuleren21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit electroporatie protocol is een betrouwbare in vivo methode voor het labelen van individuele ependymoglial cellen. Het protocol moet mogelijk een verdere aanpassing voor het labelen van andere celtypen zoals neuronen of oligodendrocyten. Om tot een succesvolle etikettering te komen, kunnen plasmiden met verschillende promotors worden gebruikt. De promotor van Chicken-Beta actine, eF1alpha, CMV en ubiquitine zijn eerder gebruikt om de expressie van verschillende transgenen in ependymoglia en hun nakomelingen<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Speciale dank aan James Copti voor het bewerken van het manuscript. We erkennen ook dankbaar financiering aan JN van de Duitse Research Foundation (DFG) door de SFB 870 en SPP “integratieve analyse van olfaction” en SPP 1738 “opkomende rollen van niet-coderende Rna’s in de ontwikkeling van het zenuwstelsel, plasticiteit & ziekte”, SPP1757 ” Glial heterogeniteit “en Excellence strategie in het kader van de Munich cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN – 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. . In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. . Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
