성체 얼룩말 기피 텔렌세팔론에서 플라스미드 DNA의 생체 내 전달을 위한 전기 개공 방법
Summary
여기서 제시된 것은 성체 제브라피쉬 텔렌세팔론에서 플라스미드 DNA 전달 및 에펜디모글리아 세포 라벨링을 위한 전기개공 방법이다. 이 프로토콜은 개별 ependymoglial 세포를 구상하고 추적하는 빠르고 효율적인 방법이며 광범위한 유전 조작에 전기 증시인을 적용할 수있는 새로운 가능성을 열어줍니다.
Abstract
전기 개출은 세포막에 일시적인 기공을 생성하고 투과성을 증가시켜 다른 분자가 세포에 도입 될 수 있도록 하는 형질전환 방법입니다. 이 논문에서, 전기 천공은 성인 얼룩말 말살기의 심실 영역을 일렬로 세워 ependymoglial 세포에 플라스미드를 소개하는 데 사용됩니다. 이들 세포의 일부분은 줄기 세포 특성을 보여주고 제브라피시 뇌에서 새로운 뉴런을 생성한다. 그러므로, 그들의 행동을 공부하는 것은 신경 발생과 재생에 있는 그들의 역할을 결정하기 위하여 필수적입니다. 전기 개공을 통해 플라스미드를 도입하면 단일 에펜디모글리아 셀의 장기 라벨링 및 추적이 가능합니다. 또한 Cre recombinase 또는 Cas9와 같은 플라스미드는 단일 ependymoglial 세포로 전달될 수 있어 유전자 재조합 또는 유전자 편집을 가능하게 하고 제어된 천연 에서 세포의 자율 적인 유전자 기능을 평가할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 환경. 마지막으로, 이 상세한, 단계별 전기 천공 프로토콜은 다수의 단일 ependymoglial 세포에 플라스미드의 성공적인 도입을 얻기 위해 사용된다.
Introduction
Zebrafish는 찔린 상처 부상 후 뇌 재생을 검사하는 우수한 동물 모델입니다. 포유류에 비해, 진화 사다리에, 제브라피시와 같은 덜 진화 된 종은 일반적으로 구성 신경 발생의 높은 비율을 보여주고 성인 신경 줄기 세포 거주의 넓은 영역, 전반에 걸쳐 새로운 뉴런의 일정한 생성으로 이어지는 성인 생활에서 대부분의 뇌 영역. 이 기능은 포유류 1에 비해 제브라피시의 상당히 높은 재생 능력과 상관 관계가 나타납니다1,제브라피쉬는 효율적으로 연구대부분의뇌 손상 모델에서 새로운 뉴런을 생성하는 놀라운 잠재력을 가지고2, 3,4,5,6,7,8. 여기에서, 얼룩말 말살론은 성인기에 있는 눈에 띄는 신경 발생을 가진 두뇌 지역이기 때문에, 공부됩니다. 이러한 성인 신경발생 영역은 성인 포유류뇌의신경발생 영역과 상동성이며9,10,11.
얼룩말기 말뇌에 풍부한 신경 영역은 세포 또는 ependymoglia 세포 같이 방사형 신경교의 존재 때문에 존재합니다. Ependymoglial 세포는 상주 성체 신경 줄기 세포역할을 하며 뇌의 손상및 재생 모두에서 새로운 뉴런의 생성을 담당하고 있으며3,5. 계보 추적 실험은 심실 ependymoglia가 상해에 반응한다는 것을 보여주었습니다, 그 때 증식하고 병변사이트5로이동하는 새로운 neuroblasts를 생성합니다. zebrafish 말뇌파의 적중특성으로 인해, ependymoglial 세포는 심실 표면을 일렬로 세우고 심실 벽을 건설합니다. 등쪽 심실 벽은 등쪽 에펜디멀 세포층에 의해 형성된다(도1A). 중요한 것은, 제브라피쉬 ependymoglia는 포유류 방사형 글리아 및 형형 세포 둘 다의 특성을 구현합니다. 긴 방사형 과정은 방사형 신경교 세포의 전형적인 특징이며, 반면 세포 확장 및 단단한 접합부 (뿐만 아니라 심실 위치)는 ependymal 세포12,13,14의전형적인 특징이다. 따라서, 이들 세포는 에펜디모글리아 세포라고 한다.
재생 중에 단일 ependymoglial 세포의 생체 내 거동을 따르려면, 그들은 안정적으로 표지 될 필요가있다. 형광 현미경 검사법에 대한 생체 내 세포 표지의 다양한 방법은 내인성 리포터 또는 친유성염료(15)와같은 이전에 기술되어 왔다. 이러한 방법은 전기 천공과는 달리 더 오랜 시간이 필요할 수 있으며 종종 단일 세포 라벨링 또는 영구 장기 추적의 가능성을 제공하지 않습니다. 전기 천공은, 그러나 (단 하나 세포 표지 이외에) 호스트 세포로 새로운 DNA를 소개의 가능성을 제안합니다. 더욱이, 세포 내로의 DNA 전달의 다른 방법에 비해, 전기천공은16,17,18,19중가장 효율적인 방법 중 하나인 것으로 입증되었다.
여기서 제시된 것은 성체 얼룩말기 말뇌골론에서 단일 에펜디모글리아 세포에 라벨을 붙이기 위한 목적으로 정제된 전기 개루 프로토콜이다. 이 프로토콜은 장기간20에 걸쳐 이를 따르거나 세포 자율 방식으로 특정 경로를 조작하기 위해 단일 ependymoglial 세포의 라벨링을허용한다 21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
이러한 전기 개공 프로토콜은 개별 에펜디모글리아 세포를 라벨링하는 신뢰할 수 있는 생체 내 방법이다. 프로토콜은 뉴런 또는 올리고엔드로시트와 같은 다른 세포 유형에 라벨을 붙이기 위해 추가적인 적응이 필요할 수 있다. 성공적인 라벨링을 달성하기 위해, 다른 프로모터를 함유하는 플라스미드를 사용할 수 있다. 치킨 베타 액틴 프로모터, eF1alpha, CMV 및 유비퀴틴 프로모터는 이전에 에펜?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고의 편집제임스 콥티에 특별한 감사. 우리는 또한 SFB 870및 SPP “Olfaction의 통합 분석”과 SPP 1738 “신경계 발달, 가소성 및 질병에서 비 코딩 RNA의 새로운 역할”, SPP1757에 의해 독일 연구 재단 (DFG)에서 JN에 자금을 감사하게 인정합니다. ” Glial 이질성”, 시스템 신경학에 대한 뮌헨 클러스터의 프레임 워크 내에서 우수 전략 (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN – 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
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