Elektro porationsmetode til in vivo-levering af plasmid-DNA i den voksne Zebrafish telencephalon
Summary
Præsenteret her er en elektroporation metode til plasmid DNA levering og ependymoglial celle mærkning i den voksne Zebra telencephalon. Denne protokol er en hurtig og effektiv metode til at visualisere og spore individuelle ependymogliale celler og åbner nye muligheder for at anvende elektro poration til en bred vifte af genetiske manipulationer.
Abstract
Elektro poration er en transfektering metode, hvor et elektrisk felt påføres celler til at skabe midlertidige porer i en celle membran og øge dens permeabilitet, hvorved forskellige molekyler, der skal indføres til cellen. I dette papir bruges elektroporation til at introducere plasmider til ependymogliale celler, som linje den ventrikulære zone af den voksne Zebra telencephalon. En brøkdel af disse celler viser stamcelle egenskaber og genererer nye neuroner i Zebra hjernen; Derfor, studere deres adfærd er afgørende for at bestemme deres roller i neurogenese og regenerering. Indførelsen af plasmider via elektroporation muliggør langsigtet mærkning og sporing af en enkelt ependymoglial celle. Desuden kan plasmider som CRE rekombinase eller Cas9 leveres til enkelt ependymogliale celler, som muliggør genkombinering eller genredigering og giver en enestående mulighed for at vurdere cellens autonome genfunktion i et kontrolleret, naturligt Miljø. Endelig er denne detaljerede, trin-for-trin elektro poration protokol anvendes til at opnå en vellykket introduktion af plasmider i et stort antal enkelt ependymoglial celler.
Introduction
Zebrafish er fremragende dyremodeller til at undersøge hjernens regenerering efter en stab sår skade. Sammenlignet med pattedyr, på den evolutionære stigen, mindre udviklede arter som Zebra generelt viser højere satser for konstitutiv neurogenese og bredere områder af voksne neurale stamceller bopæl, hvilket fører til konstant generering af nye neuroner i hele de fleste hjerneområder i voksenlivet. Denne funktion synes at korrelere med betydeligt højere regenerativ kapacitet af Zebra i forhold til pattedyr1, som zebra har bemærkelsesværdigt potentiale til effektivt at generere nye neuroner i de fleste hjerneskade modeller studerede2, 3,4,5,6,7,8. Her er Zebra telencephalon undersøgt, da det er et hjerne område med fremtrædende neurogenese i voksenalderen. Disse zoner af voksne neurogenese er homologe til neurogene zoner i den voksne pattedyr hjernen9,10,11.
Rigelige neurogene områder i Zebra telencephalon er til stede på grund af eksistensen af radial glia som celler eller ependymoglia celler. Ependymoglial celler fungerer som residente voksne neurale stamceller og er ansvarlige for generering af nye neuroner i både intakt og regenererende hjerne3,5. Lineage Tracing eksperimenter har vist, at ventrikulære ependymoglia reagerer på skade, derefter formere sig og generere nye Neuro Blaster, der migrerer til læsionsstedet5. På grund af den krænget natur af Zebra telencephalon, line ependymoglial celler den ventrikel overflade og bygge den ventrale ventrikel væg. Den dorsale ventrikel væg dannes af et dorsale ependymalt cellelag (figur 1a). Vigtigere, zebra ependymoglia legemliggøre egenskaberne af både pattedyrs radiale glia og ependymale celler. Lange radiale processer er et typisk træk ved radial glia-celler, hvorimod cellulære forlængelser og stramme kryds (samt deres ventrikulære positioner) er typiske egenskaber ved ependymale celler12,13,14. Derfor kaldes disse celler for ependymoglial celler.
For at følge in vivo opførsel af enkelt ependymoglial celler under regenerering, skal de være pålideligt mærket. Forskellige metoder til in vivo celle mærkning for fluorescerende mikroskopi er tidligere beskrevet, såsom endogene journalister eller lipofile farvestoffer15. Disse metoder, i modsætning til elektro poration, kan kræve længere perioder og ofte ikke giver mulighed for enkelt celle mærkning eller permanent langsigtet sporing. Elektro poration, men (udover enkelt celle mærkning), giver mulighed for at indføre nye DNA i værtscellen. Desuden, sammenlignet med andre metoder til DNA-overførsel i cellerne, elektro poration har vist sig at være en af de mest effektive metoder16,17,18,19.
Præsenteret her er en elektroporation protokol, der er blevet raffineret med henblik på mærkning enkelt ependymoglial celler i den voksne Zebra telencephalon. Denne protokol giver mulighed for mærkning af enkelt ependymogliale celler for at følge dem over en langsigtet periode20 eller for at manipulere bestemte veje i en celle-autonom måde21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne elektroporations protokol er en pålidelig in vivo-metode til mærkning af individuelle ependymogliale celler. Protokollen kan have brug for en yderligere tilpasning for at mærke andre celletyper såsom neuroner eller oligodendrocytter. For at opnå en vellykket mærkning kan der anvendes plasmider med forskellige initiativtagere. Chicken-beta actin Promoter, eF1alpha, CMV og ubiquitin Promoter er tidligere blevet brugt til at drive ekspression af forskellige transgener i ependymoglia og deres afkom<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Særlig tak til James Copti for redigering af manuskriptet. Vi anerkender også taknemmeligt finansiering til JN fra den tyske Research Foundation (DFG) af SFB 870 og SPP “Integrative analyse af Olfaction” og SPP 1738 “nye roller af ikke-kodning RNAs i nervesystemet udvikling, plasticitet & sygdom”, SPP1757 ” Glial heterogenitet “og ekspertise strategi inden for rammerne af München-klyngen for system Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN – 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. . In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. . Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
