वयस्क ज़ेब्राफ़िश टेलीनसेफेलॉन में प्लास्मिड डीएनए के विवो डिलिवरी के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन विधि
Summary
यहाँ प्रस्तुत प्लाज्मिड डीएनए वितरण और वयस्क ज़ेब्राफ़िश टेलीनसेफेलॉन में ependymoglial सेल लेबलिंग के लिए एक इलेक्ट्रोपोट्रेशन विधि है। इस प्रोटोकॉल कल्पना और व्यक्तिगत ependymoglial कोशिकाओं का पता लगाने और आनुवंशिक जोड़तोड़ की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इलेक्ट्रोपोट्रेशन लागू करने के लिए नई संभावनाओं को खोलता है करने के लिए एक त्वरित और कुशल तरीका है।
Abstract
विद्युत-संश्लेषण एक संक्रमण विधि है जिसमें कोशिका झिल्ली में अस्थायी छिद्र बनाने और इसकी पारगम्यता बढ़ाने के लिए कोशिकाओं पर विद्युत क्षेत्र लागू किया जाता है, जिससे कोशिका में विभिन्न अणुओं को पेश किया जा सकता है। इस पेपर में, इलेक्ट्रोपोरोनेशन का उपयोग एपेन्डीमोग्लियल कोशिकाओं को प्लाज्मिड ्सवेश करने के लिए किया जाता है, जो वयस्क जेब्राफिश टेलीनसेफेलॉन के वेंट्रिकुलर क्षेत्र को लाइन करते हैं। इन कोशिकाओं का एक अंश स्टेम सेल गुणों से पता चलता है और ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क में नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करता है; इसलिए, उनके व्यवहार का अध्ययन neurogenesis और पुनर्जनन में उनकी भूमिका निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. इलेक्ट्रोपोरिओशन के माध्यम से प्लाज्मिड की शुरूआत एक एकल ependymoglial सेल की लंबी अवधि के लेबलिंग और ट्रैकिंग सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इस तरह के क्रे recombinase या Cas9 के रूप में प्लाज्मिड एकल ependymoglial कोशिकाओं को दिया जा सकता है, जो जीन पुनर्संयोजन या जीन संपादन सक्षम बनाता है और एक नियंत्रित में सेल के स्वायत्त जीन समारोह का आकलन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है, प्राकृतिक वातावरण. अंत में, यह विस्तृत, कदम दर कदम electroporation प्रोटोकॉल एकल ependymoglial कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में प्लाज्मिड के सफल परिचय प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Introduction
ज़ेब्राफ़िश एक चाकू घाव चोट के बाद मस्तिष्क पुनर्जनन की जांच करने के लिए उत्कृष्ट पशु मॉडल हैं। स्तनधारियों की तुलना में, विकासवादी सीढ़ी पर, कम विकसित प्रजातियों जैसे ज़ेब्राफ़िश आम तौर पर गठन neurogenesis और वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल निवास के व्यापक क्षेत्रों की उच्च दर दिखाने के लिए, भर में नए न्यूरॉन्स की निरंतर पीढ़ी के लिए अग्रणी वयस्क जीवन में सबसे अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों. यह सुविधा स्तनधारियों की तुलना में जेब्राफ़िश की काफी अधिक पुनर्योजी क्षमता के साथ सहसंबंधित प्रतीत होता है1, के रूप में ज़ेब्राफ़िश सबसे मस्तिष्क चोट मॉडल में नए न्यूरॉन्स कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए उल्लेखनीय क्षमता है2का अध्ययन किया, 3,4,5,6,7,8. यहाँ, ज़ेब्राफ़िश टेलीनेसेलॉन का अध्ययन किया जाता है, क्योंकि यह वयस्कता में प्रमुख न्यूरोजेनेसिस के साथ एक मस्तिष्क क्षेत्र है। वयस्क तंत्रिकाजनन के ये क्षेत्र वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क9,10,11में न्यूरोजेनिक क्षेत्रों के लिए समजात हैं .
जेब्राफिश टेलीनसेफेलॉन में प्रचुर तंत्रिकाजन्य क्षेत्र कोशिकाओं या एपेन्डीमोग्लिया कोशिकाओं जैसे रेडियल ग्लिया के अस्तित्व के कारण मौजूद होते हैं। Ependymoglial कोशिकाओं निवासी वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के रूप में कार्य और दोनों बरकरार और regenerating मस्तिष्क3,5में नए न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए जिम्मेदार हैं . वंश अनुरेखण प्रयोगों से पता चला है कि वेंट्रिकुलर ependymoglia चोट के लिए प्रतिक्रिया है, तो proliferate और नए neuroblasts कि घाव साइट5की ओर पलायन उत्पन्न करते हैं. कारण जेब्राफिश टेलिफेलॉन की उत्क्रमित प्रकृति के कारण, एपेन्डीमोग्लियल कोशिकाएं वेंट्रिकुलर सतह को लाइन करती हैं और वेंट्रिकल दीवार का निर्माण करती हैं। पृष् ठ वेंट्रिकुलर भित् ति एक पृष् ठ एपेन्डीमल कोशिका परत द्वारा बनाई जाती है (चित्र 1क) महत्वपूर्ण बात यह है कि जेब्राफ़िश एपेन्डीमोग्लिया दोनों स्तनधारी रेडियल ग्लिया और एपेन्डीमल कोशिकाओं की विशेषताओं का प्रतीक है। लंबी रेडियल प्रक्रमों में रेडियल ग्लिया कोशिकाओं की एक विशिष्ट विशेषता होती है, जबकि कोशिकीय विस्तार और तंग संधि (साथ ही उनके वेंट्रिकुलर स्थिति) एपेन्डीमल कोशिकाओं की विशिष्ट विशेषताएं हैं12,13,14. इसलिए, इन कोशिकाओं को ependymoglial कोशिकाओं के रूप में संदर्भित कर रहे हैं.
पुनर्जनन के दौरान एकल ependymoglial कोशिकाओं के विवो व्यवहार में पालन करने के लिए, वे मज़बूती से लेबल की जरूरत है. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए विवो सेल लेबलिंग के विभिन्न तरीकों का पहले वर्णन किया गया है, जैसे अंतर्जात पत्रकारों या लिपोफिलिकरंगों 15. इन विधियों, इलेक्ट्रोपोट्रेशन के विपरीत, समय की लंबी अवधि की आवश्यकता हो सकती है और अक्सर एकल सेल लेबलिंग या स्थायी दीर्घकालिक अनुरेखण की संभावना की पेशकश नहीं करते. इलेक्ट्रोपोरेशन, हालांकि (एकल सेल लेबलिंग के अलावा), मेजबान सेल में नए डीएनए शुरू करने की संभावना प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं में डी एन ए अंतरण के अन्य विधियों की तुलना में विद्युत-प्रचालकन को16,17,18,19के सर्वाधिक कुशल विधियों में से एक माना गया है ।
यहाँ प्रस्तुत एक इलेक्ट्रोपोरोनेशन प्रोटोकॉल है कि वयस्क ज़ेब्राफ़िश telencephalon में एकल ependymoglial कोशिकाओं लेबलिंग के उद्देश्य के लिए परिष्कृत किया गया है. इस प्रोटोकॉल एकल ependymoglial कोशिकाओं की लेबलिंग के लिए अनुमति देता है ताकि उन्हें एक लंबी अवधि20 पर पालन करने के लिए या एक सेल स्वायत्त तरीके से विशिष्ट रास्ते में हेरफेर करने के लिए21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
यह इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रोटोकॉल व्यक्तिगत ependymoglial कोशिकाओं लेबलिंग की vivo विधि में एक विश्वसनीय है. प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स या oligodendrocytes के रूप में अन्य सेल प्रकार लेबल करने के लिए एक और अनुकूलन की आवश्यकता हो स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
पांडुलिपि के संपादन के लिए जेम्स Copti के लिए विशेष धन्यवाद. हम भी आभारी जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (DFG) से जेएन के लिए धन SFB 870 और एसपीपी द्वारा “Olfaction के एकीकृत विश्लेषण” और SPP 1738 “नर्वस सिस्टम के विकास में गैर-कोडिंग आरएनए की भूमिका, प्लास्टिक और रोग”, SPP1757 ” Glial विषमता”, और उत्कृष्टता रणनीति सिस्टम न्यूरोलॉजी के लिए म्यूनिख क्लस्टर के ढांचे के भीतर (EXC 2145 SyNergy – आईडी 390857198).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN – 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
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