Elektroporation metod för in vivo leverans av plasmid DNA i den vuxna Zebrafish telencephalon
Summary
Presenteras här är en elektroporation metod för plasmid DNA leverans och ependymoglial cell märkning i den vuxna zebrafiskar telencephalon. Detta protokoll är en snabb och effektiv metod för att visualisera och spåra enskilda ependymoglial celler och öppnar upp nya möjligheter att tillämpa elektroporation till ett brett spektrum av genetiska manipulationer.
Abstract
Electroporation är en transfektion metod där ett elektriskt fält appliceras på celler för att skapa tillfälliga porer i ett cellmembran och öka dess permeabilitet, vilket gör att olika molekyler som skall införas i cellen. I detta papper, är elektroporation används för att införa plasmider till ependymoglial celler, som linje ventrikulär zon av den vuxna zebrafiskar telencephalon. En bråkdel av dessa celler visar stamcells egenskaper och genererar nya nervceller i zebrafiskar hjärnan; Därför är det viktigt att studera deras beteende för att avgöra deras roller i neurogenes och regeneration. Införandet av plasmider via elektroporation möjliggör långsiktig märkning och spårning av en enda ependymoglial cell. Dessutom kan plasmider som CRE driver eller Cas9 levereras till en enda ependymoglial celler, vilket möjliggör genrekombination eller genredigering och ger en unik möjlighet att bedöma cellens autonoma genfunktion i en kontrollerad, Naturlig Miljö. Slutligen, denna detaljerade, steg-för-steg elektroporation protokoll används för att få framgångsrikt införande av plasmider i ett stort antal enda ependymoglial celler.
Introduction
Zebrafish är utmärkta djurmodeller för att undersöka hjärnans förnyelse efter en knivhugg sårskada. I jämförelse med däggdjur, på den evolutionära stege, mindre utvecklade arter såsom zebrafiskar allmänhet visar högre priser av konstitutiva neurogenes och bredare områden av vuxna neurala stamceller bosättning, vilket leder till ständig generering av nya nervceller i hela de flesta hjärnområden i vuxenlivet. Denna funktion verkar korrelera med betydligt högre regenerativ kapacitet av zebrafisk i jämförelse med däggdjur1, som zebrafiskar har anmärkningsvärd potential att effektivt generera nya nervceller i de flesta hjärnskada modeller studerade2, 3,4,5,6,7,8. Här är zebrafiskar telencephalon studeras, eftersom det är ett hjärnområde med framstående neurogenes i vuxen ålder. Dessa zoner av vuxna neurogenes är homolog till neurogena zoner i den vuxna däggdjurs hjärnan9,10,11.
Rikliga neurogena områden i zebrafiskar telencephalon är närvarande på grund av förekomsten av radiella glia som celler eller ependymoglia celler. Ependymoglial celler fungerar som bosatta vuxna neurala stamceller och är ansvariga för generering av nya nervceller i både intakt och regenererande hjärnan3,5. Härstamning experiment har visat att ventrikulär ependymoglia reagera på skada, sedan förgöra och generera nya neuroblaster som migrerar till lesion plats5. På grund av den vrängs natur zebrafiskar telencephalon, ependymoglial celler linje ventrikulära ytan och bygga ventrala ventrikulära väggen. Den dorsala ventrikulära väggen bildas av en dorsala ependymceller cellskikt (figur 1a). Viktigt är att zebrafiskar ependymoglia förkroppsligar egenskaperna hos både radiella glia-och ependymalceller från däggdjur. Långa radiella processer är typiska för radiala glia-celler, medan cellulära förlängningar och täta korsningar (liksom deras ventrikulära positioner) är typiska egenskaper hos ependymala celler12,13,14. Därför är dessa celler kallas ependymoglial celler.
För att följa in vivo beteende av enskilda ependymoglial celler under förnyelse, de måste vara tillförlitligt märkta. Olika metoder för in vivo cell märkning för fluorescerande mikroskopi har beskrivits tidigare, såsom endogena reportrar eller lipofila färgämnen15. Dessa metoder, i motsats till elektroporation, kan kräva längre tidsperioder och ofta inte erbjuder möjligheten att Single cell märkning eller permanent långsiktig spårning. Elektroporation, men (förutom Single cell märkning), erbjuder möjligheten att införa nya DNA i värdcellen. Dessutom, jämfört med andra metoder för DNA-överföring i cellerna, har elektroporation visat sig vara en av de mest effektiva metoderna16,17,18,19.
Presenteras här är en elektroporation protokoll som har förfinats i syfte att märka enda ependymoglial celler i den vuxna zebrafiskar telencephalon. Detta protokoll medger märkning av enstaka ependymoglialceller för att följa dem över en långsiktig period20 eller för att manipulera specifika vägar i ett cell självständigt sätt21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta elektroporation protokoll är en pålitlig in vivo metod för märkning enskilda ependymoglial celler. Protokollet kan behöva en ytterligare anpassning för att märka andra celltyper såsom nervceller eller oligodendrocyter. För att uppnå en lyckad märkning kan plasmider som innehåller olika projektansvariga användas. “Chicken-beta aktin promotor, eF1alpha, CMV och ubiquitin promotor” har tidigare använts för att driva uttrycket av olika transgener i ependymoglia och deras avkomman23</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Speciellt tack till James Copti för redigering av manuskriptet. Vi erkänner också tacksamt finansiering till JN från den tyska Research Foundation (DFG) av SFB 870 och SPP “integrativ analys av Olfaction” och SPP 1738 “framväxande roller icke-kodning RNAs i nervsystemet utveckling, plasticitet & sjukdom”, SPP1757 ” Glial heterogenitet “, och Excellence strategi inom ramen för München cluster för system Neurology (EXC 2145 SyNergy-ID 390857198).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN – 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. . In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. . Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
