Chronische Salmonelleninfektion induzierte Darmfibrose

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell der Salmonellen-getriebenen Darmfibrose, die den wichtigsten pathologischen Merkmalen der Morbus Crohn ähnelt, einschließlich transmuraler Entzündungen und Fibrose. Diese Methode kann verwendet werden, um Wirtsfaktoren zu bewerten, die fibrotische Ergebnisse mit mutierten Mäusen verändern, die auf einem c57Bl/6 genetischen Hintergrund gehalten werden.

Abstract

Gewebefibrose, die durch die pathologische Ansammlung extrazellulärer Matrix wie Kollagen gekennzeichnet ist das Ergebnis einer anhaltenden Entzündung und dysregulierten Reparatur. Bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) führt Fibrose zu wiederkehrenden Stricture-Formationen, für die es keine andere wirksame Therapie als chirurgische Resektion gibt. Aufgrund seines späten Beginns sind die Prozesse, die Fibrose antreiben, weniger untersucht und weitgehend unbekannt. Daher stellen fibrotische Komplikationen eine große Herausforderung bei IBD dar. In diesem Protokoll wird ein robustes In-vivo-Modell der Darmfibrose beschrieben, bei dem Streptomycin-Vorbehandlung von C57Bl/6-Mäusen, gefolgt von oraler Gavage mit Deminfizierung s. Fibrose des Cecums. Methoden zur Vorbereitung von S. Typhimurium -AroA zur Impfung, Quantifizierung von Pathogenlasten im Cecum und Milz und Bewertung der Kollagenablagerung in Darmgewebewerden werden erläutert. Dieses experimentelle Krankheitsmodell ist nützlich für die Untersuchung von Wirtsfaktoren, die CD-ähnliche Darmfibrose entweder verstärken oder verschlimmern.

Introduction

Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD) sind die beiden Hauptformen der IBD und werden als chronische und schubförmige entzündliche Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes ^1,2charakterisiert. Diese Störungen haben einen großen Einfluss auf die Lebensqualität der Patienten. Symptome von IBD sind Bauchschmerzen, Durchfall, Übelkeit, Gewichtsverlust, Fieber, und Müdigkeit³. Jüngste Studien haben genetische und Ökologische Faktoren identifiziert, die zur Pathogenese von Krankheiten beitragen; Es wird angenommen, dass solche Risikofaktoren zur Störung der Epithelbarriere beitragen, die zur Translokation oder Überprobenahmung von luminalen Antigenen⁴führt. Als Folge löst dies eine abnorme Entzündungsreaktion auf die beginnende Flora aus, die durch Darmimmunzellen vermittelt wird⁴. Merkmale der IBD-assoziierten Komplikationen können sich auf Standorte außerhalb des GI-Traktes erstrecken, die verschiedene Organe einschließlich Gelenke, Haut und Leber^{betreffen 1,2}. Markenzeichen von UC sind schwere und diffuse Entzündungen, die typischerweise im Dickdarm¹lokalisiert sind. Krankheitspathologie wirkt sich auf die Schleimhaut und Submukose des Darms, was zu oberflächlichen Schleimhautgeschwüren¹. Im Gegensatz dazu kann CD jeden Teil des GI-Traktes beeinflussen, obwohl Beweise für Krankheiten häufig im Dickdarm und distalen Ileum²gefunden werden. Darüber hinaus ist die Entzündung in CD transmural, die alle Schichten der Darmwand^{betrifft 2}.

Mehrere identifizierte IBD-Anfälligkeitsgene würden darauf hindeuten, dass die Dysregulation der Epithelbarriere oder -immunität einen kritischen Beitrag zum Fortschreiten der Krankheit s.⁵leistet. Mutationen in Dernuleotid-Oligomerisierungsdomäne 2 (NOD2), ausgedrückt durch Monozyten, wurden mit einer erhöhten Anfälligkeit für CD in Verbindung gebracht; Dies zeigt einen Zusammenhang zwischen dem veränderten angeborenen Immundetektion von bakteriellen Komponenten und der Krankheit⁶. Neuere genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben zusätzliche Wege ergeben, die potenziell an der Pathogenese von IBD beteiligt sind, einschließlich genetischer Variationen in: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R-abhängigen Pfaden verbunden mit adaptiver Immunität, MUC1, MUC19und PTGER4 bei der Wartung von Darmbarrieren und ATG16L-vermittelter Autophagie^7,8,9. Während diese bevölkerungsbasierten genetischen Studien unser Verständnis von IBD verbessert haben, sind Anfälligkeitsallele allein wahrscheinlich nicht ausreichend, um chronische Krankheiten zu ins Leben zu erhalten und zu erhalten³. Andere nicht-genetische Faktoren wie Veränderungen in der Darmmikrobiomzusammensetzung und eine Verringerung der Diversität wurden mit Darmentzündungen in Verbindung gebracht. Es ist jedoch unklar, ob Darmdysbiose vorsteht oder die Folge von dysregulierten Immunantworten³ist. Obwohl die Ätiologie der IBD unklar bleibt, wurde unser Verständnis der Pathogenese der Krankheit durch experimentelle Mausmodelle der Darmentzündung^10,11verbessert. Diese Modelle stellen einzeln nicht vollständig die Komplexität der menschlichen Krankheit dar, aber sie sind wertvoll für die Aufklärung pathophysiologischer Pfade, die für IBD relevant sein könnten, und für die Validierung vorläufiger therapeutischer Strategien^{10, 11}. Solche Mausmodelle verlassen sich in der Regel auf die Einleitung von Entzündungen durch chemische Induktion oder Infektion, Immunzelltransfer oder genetische Manipulation. Darüber hinaus beinhalten diese Strategien oft Störungen in der epitheliaalen Integrität oder Modulation der angeborenen oder adaptiven Immunität.

Salmonella enterica serovars sind Darmpathogene, die Menschen und Mäuse infizieren können. Nach der Einnahme können Salmonellen den Darm durch direkte Invasion von Epithelien, M-Zellen oder Antigen-präsentierenden Zellen¹²besiedeln. Mäuse oral mit S infiziert Typhimurium führt zur Kolonisierung in erster Linie von systemischen Stellen wie der Milz und mesenterischen Lymphknoten mit relativ geringer Häufigkeit im GI-Trakt¹². Jedoch, Vorbehandlung von Mäusen mit Streptomycin verbessert die Effizienz der Salmonellen-Kolonisation des Darms durch Verringerung der Wirt schutzfördernde Wirkung der normalen Mikrobiota¹³. Zu den pathologischen Merkmalen dieses Modells gehören die Störung oder Ulzeration der Epithelbarriere, granulozyte Rekrutierung und schwere Ödeme¹³. Alternativ kann eine Infektion mit der Impfstoffklasse S. Typhimurium -AroA Mutant führt zu chronischer Kolonisation des Zecums und Dickdarms, die bis zum Tag 40 nach der Infektion¹⁴anhält. Die S. Typhimurium -AroA-Stamm hat einen Defekt in der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren; Dies macht den mutierten Stamm avirulent und kann als hochwirksamer Impfstoff verwendet werden¹⁵. Eine orale Infektion bei Mäusen führt zu einer Th1- und Th17-Zytokin-assoziierten Entzündungsreaktion, einer umfassenden Gewebeumgestaltung und Kollagenablagerung. Gewebepathologie ist verbunden mit erhöhten Niveaus der pro-fibrotischen Faktor wie TGF-Nr. 1, CTGF, und IGF¹⁴. Die in diesem Modell berichtete transmurale fibrotische Narbenbildung erinnert an Strengeformationen, die häufig bei IBD beobachtet werden. Die Induktion von Fibrose durch Salmonellen erfordert Virulenz, kodiert durch Salmonella Pathogenitätsinseln (SPI)-1 und 2 ¹². Wichtig ist, dass dieses S. Tymphimurium -AroA-Infektionsmodell ist ein nützliches System für die Untersuchung von fibrotischen Reaktionen bei mutierten Mäusen, die auf einem C57/Bl6-Hintergrund gehalten werden. Die C57/Bl6-Sorte ist extrem empfindlich gegenüber S. Typhiumurim SL1344-Infektion aufgrund einer Funktionsverlustmutation im Gen, die das natürliche resistenzassoziierte Makrophagenprotein (NRAMP)-1^16,17kodiert. Wir haben herausgefunden, dass IL-17A und ROR-abhängige lymphoide Zellen wichtige Beiträge zur Pathogenese in diesem Modell¹⁸sind.

Eine hauptverkompliktäre CD ist die dysregulierte und übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix (ECM) einschließlich Kollagen^2,19. Obwohl der GI-Trakt eine relativ hohe Regenerationsfähigkeit hat, kann fibrotische Narbenbildung durch ungelöste Wundheilungsreaktionen entstehen, die mit chronischen und schweren Entzündungen verbunden sind^20,21. In CD führt dies zu schädlichen Auswirkungen auf die Gewebearchitektur, die zu einer signifikanten Organbeeinträchtigung führt^21,22. Die transmurale Natur der entzündung, die in CD beobachtet wird, geht letztlich der Verdickung der Darmwand voraus, die mit symptomatischer Stenose oder Striktbildung verbunden ist²¹. Etwa ein Drittel der CD-Patienten benötigen eine Darmresektion für diese Komplikation²². Es gibt keine wirksamen antifibrotischen Therapien in IBD, da die Verwendung von Immunsuppressiva wie Azathioprin oder Anti-TNF-Biologika keine Auswirkungen haben oder nur geringfügig den Bedarf an chirurgischen Eingriffen reduziert^19,23 . Während Fibrose wird angenommen, dass die Folge der chronischen Entzündung, Zellen mesenchymaler Herkunft wie Fibroblasten und Pericyten werden gedacht, um die primären zellulären Quellen von ECM in fibrotischen Narben^21,24. Chronische S. Typhimurium -AroA-Infektion ist ein robustes Mausmodell der Darmfibrose, das Einblicke in die Pathogenese von CD-ähnlichen Merkmalen bieten kann.

Protocol

Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care Committee der University of British Columbia genehmigt. 1. Herstellung von Salmonella Typhimurium -AroA-Kulturen zur oralen Gavage von Mäusen Aus einem gefrorenen Glycerinbestand von S. Typhimurium -AroA, bereiten Sie eine Streifenplatte mit LB-Agar mit 100 g/ml Streptomycin mit einer sterilen Impfschleife vor. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Streifenplatten können bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden. <l…

Representative Results

Streptomycin-Behandlung gefolgt von einer oralen Infektion mit S. Typhimurium -AroA führt zu robusten Darmentzündungen und Fibrose vor allem im Cecum (Abbildung 1). Typische Krankheitsbelastungen von 108 bis 109 KBE pro 1 g Cecum und 104 KBE pro 1 g Milz können von infizierten Tieren zurückgewonnen werden (Abbildung 2). Die Beurteilung der Fibrose in picrosirius rot gefärbten Cecal-Abschnitten zeigt Spitzenfibrose 2…

Discussion

Unser Verständnis der Pathogenese von IBD wurde durch Mausmodelle von Darmentzündungen erheblich verbessert. Obwohl solche einzelseitigen Modelle nicht alle Merkmale der komplexen und multifaktoriellen menschlichen Krankheit rekapitulieren, waren sie nützlich bei der Identifizierung von Schlüsselmerkmalen des Krankheitsverlaufs. Fibrotische Strenge im Zusammenhang mit IBD bleibt ein großer unerfüllter klinischer Bedarf, da aktuelle Behandlungen bei der Umkehrung der Krankheitsentwicklung wirkungslos sind. Darüber …

Materials

2 ml round bottom safe lock tubes	Eppendorf	22363344
Stainless steel beads	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
Large-Orifice Pipet Tips	Fisher	2707134
2 mL megablock plates	Sarstedt	82.1972.002
Gavage needles	FST	18061-22
Streptomycin sulfate	Sigma	S9137
Mixer mill	Retsch	MM