Хроническая инфекция сальмонеллы индуцированных кишечный фиброз
Summary
Этот протокол описывает модель мыши Сальмонеллы инициативе кишечного фиброза, который напоминает ключевые патологические признаки болезни Крона, включая трансмурльное воспаление и фиброз. Этот метод может быть использован для оценки факторов, которые изменяют фиброзные исходы с помощью мышей-мутантов поддерживается на C57Bl/6 генетического фона.
Abstract
Ткань фиброз характеризуется патологическим накоплением внеклеточной матрицы, такие как коллаген является результатом постоянного воспаления и дисрегулируемого ремонта. При воспалительных заболеваниях кишечника (IBD) фиброз приводит к периодическим стрикционным образованиям, для которых нет эффективной терапии, кроме хирургической резекции. Из-за его позднего начала, процессы, которые управляют фиброзом менее изучены и в значительной степени неизвестны. Таким образом, фиброзные осложнения представляют собой серьезную проблему в IBD. В этом протоколе, надежная модель in vivo кишечного фиброза описывается, где стрептомицин предварительной обработки C57Bl/6 мышей следуют устные gavage с вакциной класса Salmonella Typhimurium мутант ароА приводит к стойкой колонизации патогена и фиброз цекума. Методики подготовки С. Объясняется тифимурий ЗароА для прививки, количественной оценки патогенных нагрузок в цекуме и селезенке, а также оценки осаждения коллагена в тканях кишечника. Эта экспериментальная модель заболевания полезна для изучения факторов, которые либо усиливают, либо усугубляют CD-подобный кишечный фиброз.
Introduction
Язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD) являются двумя основными формами IBD и характеризуются как хронические и рецидивирующих воспалительных расстройств желудочно-кишечного тракта 1,2. Эти расстройства оказывают значительное влияние на качество жизни пациентов. Симптомы IBD включают боли в животе, диарея, тошнота, потеря веса, лихорадка, и усталость3. Недавние исследования выявили генетические и экологические факторы, способствующие патогенеза болезней; считается, что такие факторы риска способствуют нарушению эпителиального барьера, что приводит к транслокации или перевыборе светящихся антигенов4. Как следствие, это инициирует аномальную воспалительную реакцию на коммунальную флору, опосредованный кишечными иммунными клетками4. Особенности IBD-связанных осложнений может распространяться на сайты за пределами желудочно-кишечного тракта, затрагивающих различные органы, включая суставы, кожу и печень1,2. Признаки UC включают тяжелые и диффузное воспаление обычно локализованы в толстой кишке1. Патология заболеваний поражает слизистую оболочку и субмукоз кишечника, что приводит к поверхностным язвам слизистойоболочки 1. В отличие от этого, CD может повлиять на любую часть желудочно-кишечного тракта, хотя доказательства болезни обычно встречаются в толстой кишке и дистальном илеуме2. Кроме того, воспаление в CD является трансмуральным, затрагивающих все слои стенки кишечника2.
Несколько генов восприимчивости IBD, которые были определены будет означать, что дисрегуляция эпителиального барьера или иммунитета являются критическиважными факторами прогрессирования болезни5. Мутации в домене нуклеотидной олигомеризации 2 (NOD2), выраженные моноцитами, были связаны с повышенной восприимчивостью к CD; это подчеркивает связь между измененным врожденным иммунным обнаружением бактериальных компонентов и заболеванием6. Более поздние исследования ассоциации генома (GWAS) выявили дополнительные пути, потенциально участвующие в патогенеза IBD, включая генетические вариации в: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R зависимых путей связаны с адаптивным иммунитетом, MUC1, MUC19, и PTGER4 в кишечном барьере обслуживания, и ATG16L-опосредованныйаутофагии7,8,9. Хотя эти популяционные исследования генетики улучшили наше понимание IBD, восприимчивость аллелей только, вероятно, недостаточно в иначинии и поддержания хронических заболеваний3. Другие негенетические факторы, включая изменения в составе микрофлоры кишечника и уменьшение разнообразия, были связаны с воспалением кишечника. Тем не менее, неясно, является ли дисбактериоз кишечника предшествует или является следствием дисрегулируемых иммунных реакций3. Хотя этиология IBD остается неясным, наше понимание патогенеза болезни была усилена экспериментальных моделей мыши кишечного воспаления10,11. Эти модели индивидуально не в полной мере представляют сложность болезни человека, но они являются ценными для выяснения патофизиологических путей, которые могут иметь отношение к IBD и для проверки предварительных терапевтических стратегий10, 11. Такие модели мыши обычно полагаются на начало воспаления химической индукции или инфекции, передачи иммунных клеток, или генетические манипуляции. Кроме того, эти стратегии часто включают возмущения в эпителиальной целостности или модуляции врожденного или адаптивного иммунитета.
Salmonella enterica серовары кишечных патогенов, которые могут инфицировать людей и мышей. После приема, Salmonella может колонизировать кишечник путем прямого вторжения эпителии, M клеток, или антигена представления клеток12. Мыши, инфицированные устно С. Typhimurium приводит к колонизации в первую очередь системных сайтов, таких как селезенка и брюшной лимфатической узлы с относительно низким изобилием в желудочно-кишечном тракте12. Тем не менее, предварительное лечение мышей стрептомицин повышает эффективность колонизации кишечника сальмонеллы за счет уменьшения принимающей защитные эффекты нормальной микробиоты13. Патологические особенности этой модели включают нарушение или язву эпителиального барьера, набор гранулоцитов и тяжелый отек13. Кроме того, инфекция вакциной класса S. Тифимурий ЗароА мутант приводит к хронической колонизации цекум и толстой кишки, которая сохраняется до дня 40 после инфекции14. С. Штамм Тифимурий ЗароА имеет дефект в биосинтезе ароматических аминокислот; это делает мутант штамм аврулентным и может быть использован в качестве высокоэффективной вакцины15. Устные инфекции у мышей приводит к Th1- и Th17-цитокинов связанных воспалительных ответ, обширные ткани ремоделирования, и осаждение коллагена. Ткань патологии связано с повышенным уровнем профиброзного фактора, таких как TGF-No1, CTGF, и IGF14. Трансморфальные фиброзные рубцы, зарегистрированные в этой модели, напоминают стриктурные образования, часто наблюдаемые в IBD. Индукция фиброза сальмонеллой требует вирулентности, кодированной патогенными островами Salmonella (SPI)-1 и 2 12. Важно, что это С. Модель инфекции Tymphimurium qAroA является полезной системой для изучения фиброзных реакций у мышей-мутантов, поддерживаемых на фоне C57/Bl6. Штамм C57/Bl6 чрезвычайно чувствителен к S. Typhiumurim SL1344 инфекция из-за потери функции мутации в гене кодирования естественной резистентности связанных макрофаг белка (NRAMP)-116,17. Мы обнаружили, что IL-17A и ROR-зависимые врожденные лимфоидные клетки являются важными факторами, способствующими патогенеза в этой модели18.
Основным осложнением CD является дисрегулируемое и чрезмерное осаждение внеклеточной матрицы (ECM), включая коллаген2,19. Хотя желудочно-кишечного тракта имеет относительно высокую способность к регенерации, фиброзные рубцы могут возникнуть из-за нерешенных реакций заживления ран, которые связаны с хроническим и тяжелым воспалением20,21. В CD, это приводит к пагубным последствиям для архитектуры тканей, что приводит к значительным нарушениям органов21,22. Трансмуральный характер воспаления наблюдается в CD в конечном счете предшествует утолщение стенки кишечника, связанные с симптоматическим стенозом или стриктурного образования21. Около трети пациентов cd требуют резекции кишечника для этого осложнения22. В IBD нет эффективных противофиброзных методов лечения, учитывая, что использование иммунодепрессантов, таких как азатиоприн или биопрепараты против ТНФЗ, не оказывает никакого влияния или лишь незначительно снижает потребность в хирургических вмешательствах19,23 . Хотя фиброз считается следствием хронического воспаления, клетки мезенхимального происхождения, такие как фибробласты и перициты, как полагают, являются основными клеточными источниками ECM в фиброзных рубцов21,24. Хронический С. Typhimurium ЗароА инфекции является надежной моделью мыши кишечного фиброза, которые могут предложить понимание патогенеза CD-подобных функций.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наше понимание патогенеза IBD было значительно усилено мышимодели кишечного воспаления. Хотя такие индивидуальные модели не подизглажают все особенности сложной и многофакторной болезни человека, они были полезны для выявления ключевых особенностей прогрессирования заболевания. Фиб…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Ингрид Барта за гистологические услуги.
Materials
| 2 ml round bottom safe lock tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| PBS | Gibco | 10010031 | |
| Large-Orifice Pipet Tips | Fisher | 2707134 | |
| 2 mL megablock plates | Sarstedt | 82.1972.002 | |
| Gavage needles | FST | 18061-22 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Mixer mill | Retsch | MM |
References
- Danese, S., Fiocchi, C. Ulcerative colitis. New England Journal of Medicine. 365 (18), 1713-1725 (2011).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. The Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome. Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
- Cho, J. H. The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature Reviews Immunology. 8 (6), 458-466 (2008).
- Ogura, Y., et al. A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn’s disease. Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).
- Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
- Rivas, M. A., et al. Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease. Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).
- Rioux, J. D., et al. Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis. Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).
- Uhlig, H. H., Powrie, F. Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease. European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Grassl, G. A., Finlay, B. B. Pathogenesis of enteric Salmonella infections. Current Opinion in Gastroenterology. 24 (1), 22-26 (2008).
- Barthel, M., et al. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
- Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance. Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).
- Valdez, Y., et al. Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice. Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).
- Lo, B. C., et al. The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn’s disease. Science Immunology. 1 (3), eaaf8864 (2016).
- Burke, J. P., et al. Fibrogenesis in Crohn’s disease. American Journal of Gastroenterology. 102 (2), 439-448 (2007).
- Hogan, B. L., et al. Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function. Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).
- Fiocchi, C., Lund, P. K. Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).
- Rieder, F., Fiocchi, C. Intestinal fibrosis in IBD—a dynamic, multifactorial process. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 6 (4), 228-235 (2009).
- Bouguen, G., Peyrin-Biroulet, L. Surgery for adult Crohn’s disease: what is the actual risk?. Gut. 60 (9), 1178-1181 (2011).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of Pathology. 214 (2), 199-210 (2008).
- Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
- Lo, B. C., et al. IL-22 Preserves Gut Epithelial Integrity and Promotes Disease Remission during Chronic Salmonella Infection. Journal of Immunology. 202 (3), 956-965 (2019).
- Fichtner-Feigl, S., et al. Induction of IL-13 triggers TGF-beta1-dependent tissue fibrosis in chronic 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis. Journal of Immunology. 178 (9), 5859-5870 (2007).
- Fichtner-Feigl, S., et al. IL-13 signaling via IL-13R alpha2 induces major downstream fibrogenic factors mediating fibrosis in chronic TNBS colitis. Gastroenterology. 135 (6), e2001-e2007 (2013).
- Johnson, L. A., et al. Intestinal fibrosis is reduced by early elimination of inflammation in a mouse model of IBD: impact of a "Top-Down" approach to intestinal fibrosis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (3), 460-471 (2012).
- Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn’s disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
- Small, C. L., Reid-Yu, S. A., McPhee, J. B., Coombes, B. K. Persistent infection with Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli leads to chronic inflammation and intestinal fibrosis. Nature Communications. 4, 1957 (2013).
- Imai, J., et al. Flagellin-mediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. , (2019).
