Kronisk Salmonella infeksjon indusert intestinal fibrose

Summary

Denne protokollen beskriver en mus modell av Salmonella drevet intestinal fibrose som ligner viktige patologiske kjennetegn ved Crohns sykdom, inkludert transmuralt inflammasjon og fibrose. Denne metoden kan brukes til å evaluere verts faktorer som endrer antifibrotiske utfall ved hjelp av mutant mus opprettholdt på en C57Bl/6 genetisk bakgrunn.

Abstract

Vev fibrose karakterisert ved patologisk akkumulering av ekstracellulære matrise som kollagen er utfallet av vedvarende betennelse og dysregulated reparasjon. I inflammatorisk tarmsykdom (IBD) fører fibrose til tilbakevendende striktur formasjoner som det ikke er noen effektiv behandling enn kirurgisk reseksjon. På grunn av sin sene debut, er prosessene som driver fibrose mindre studert og i stor grad ukjent. Derfor antifibrotiske komplikasjoner representerer en stor utfordring i IBD. I denne protokollen, en robust in vivo modell av intestinal fibrose er beskrevet der Streptomycin pre-behandling av C57Bl/6 mus etterfulgt av oral gavage med vaksine grade Salmonella tyfimurium ΔAroA mutant fører til vedvarende patogen kolonisering og fibrose i cecum. Metoder for å forberede S. Tyfimurium ΔAroA for inoculation, kvantifisere patogen belastninger i cecum og milt, og evaluere kollagen deponering i intestinal vev er forklart. Denne eksperimentelle sykdommen modellen er nyttig for å undersøke verten faktorer som enten forsterke eller forverre CD-lignende intestinal fibrose.

Introduction

Ulcerøs kolitt (UC) og Crohns sykdom (CD) er de to store formene for IBD og er karakterisert som kroniske og relapsing inflammatoriske forstyrrelser i mage-tarmkanalen ^1,2. Disse lidelsene har en stor innvirkning på livskvaliteten til pasientene. Symptomer på IBD inkluderer magesmerter, diaré, kvalme, vekttap, feber og tretthet³. Nyere studier har identifisert genetiske og miljømessige faktorer som bidrar til sykdom patogenesen; Det er antatt at slike risikofaktorer bidrar til forstyrrelsen av epitel barrieren, noe som resulterer i translokasjon eller oversampling av luminal antigener⁴. Som en konsekvens, initierer dette en avvikende inflammatorisk respons på Commensal flora formidlet av tarm immunceller⁴. Vise egenskaper av IBD-forbundet komplikasjoner kanskje forlenge å steder over det gi luftveiene kjærligheten forskjellige organ inkluderer skjøt, hud, og lever^1,2. Kjennetegn ved UC inkluderer alvorlig og diffus betennelse vanligvis lokalisert i kolon¹. Sykdom patologi påvirker slimhinnen og submukosa i tarmen som resulterer i overfladisk slimhinne ulcerasjon¹. I kontrast, kan CD påvirke noen del av GI-tarmkanalen selv om tegn på sykdom er ofte funnet i tykktarmen og ileum². Videre er betennelsen i CD transmuralt, berører alle lag av tarmveggen².

Flere IBD mottakelighet gener som er identifisert vil indikere at feilregulering av epitel barriere eller immunitet er kritiske bidragsytere til sykdomsprogresjon⁵. Mutasjoner i nukleotid oligomerisering domene 2 (NOD2) uttrykt ved monocytter ble funnet å være assosiert med økt mottakelighet for CD; Dette fremhever en kobling mellom endrede medfødte immun deteksjon av bakterielle komponenter og sykdommen⁶. Nyere Genova-brede foreningen studier (GWAS) har avdekket flere trasé potensielt involvert i patogenesen av IBD inkludert genetiske variasjoner i: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R avhengige trasé knyttet til adaptive immunitet, MUC1, MUC19, og PTGER4 i intestinal barriere vedlikehold, og ATG16L-mediert autofagi^7,8,9. Mens disse befolknings-baserte genetikk studier har styrket vår forståelse av IBD, mottakelighet alleler alene er sannsynligvis utilstrekkelig i initiering og opprettholde kronisk sykdom³. Andre ikke-genetiske faktorer, inkludert endringer i tarm mikrobiomet sammensetning og en reduksjon i mangfold, har blitt assosiert med tarmbetennelse. Det er imidlertid uklart om gut dysbiosis foran eller er konsekvensen av dysregulated immunresponser³. Selv om etiologi av IBD fortsatt er uklart, har vår forståelse av patogenesen av sykdommen blitt forsterket av eksperimentelle musemodeller av intestinal betennelse^10,11. Disse modellene individuelt ikke fullt ut representerer kompleksiteten i den menneskelige sykdommen, men de er verdifulle for Elucidating patofysiologiske trasé som kan være relevant for IBD og for validering av foreløpige terapeutiske strategier^{10, 11}i. Slike mus modeller vanligvis stole på initiering av betennelse ved kjemisk induksjon eller infeksjon, immun celle overføring, eller genetisk manipulasjon. Videre disse strategiene ofte innebære forstyrrelser i epitel integritet eller modulering av medfødt eller adaptiv immunitet.

Salmonella enterica serovarer er intestinal patogener som kan infisere mennesker og mus. Etter inntak, Salmonella kanne kolonisere tarmen av direkte invasjonen av Prolifererende, M celler, eller antigen presenterer celler¹². Mus smittet muntlig med S. Tyfimurium resulterer i kolonisering hovedsakelig av systemiske nettsteder som milt og chrezbryzheechno lymfeknuter med relativt lav overflod i mage-tarmkanalen¹². Men forbehandling av mus med Streptomycin forbedrer effektiviteten av Salmonella kolonisering av tarmen ved å redusere verten beskyttende effekter av normal bakterieflora¹³. Patologiske trekk ved denne modellen inkluderer avbrudd eller sårdannelse i epitel barrieren, granulocytt rekruttering, og alvorlig ødem¹³. Alternativt, infeksjon med vaksinen karakteren S. Tyfimurium ΔAroA mutant fører til kronisk kolonisering av cecum og kolon som vedvarer opp til dag 40 etter infeksjon¹⁴. S. Tyfimurium ΔAroA stamme har en defekt i biosyntesen av aromatiske aminosyrer; Dette gjengir mutant stamme avirulent og kan benyttes som en svært effektiv vaksine¹⁵. Oral infeksjon i mus fører til en Th1-og Th17-cytokin tilhørende inflammatorisk respons, omfattende vev remodeling, og kollagen deponering. Tissue patologi er forbundet med forhøyede nivåer av Pro-antifibrotiske faktor som TGF-β1, CTGF, og IGF¹⁴. Den transmuralt antifibrotiske arrdannelse rapportert i denne modellen minner om striktur formasjoner ofte observert i IBD. Induksjon av fibrose ved Salmonella krever virulens kodet av Salmonella patogenitet øyer (SPI)-1 og 2 ¹². Viktigere, dette S. Tymphimurium ΔAroA infeksjon modellen er et nyttig system for studiet av antifibrotiske responser i mutant mus opprettholdes på en C57/Bl6 bakgrunn. C57/Bl6-belastningen er svært følsom for S. Typhiumurim SL1344 infeksjon på grunn av en taps-av-funksjon mutasjon i genet koding naturlig motstand-assosiert macrophage protein (NRAMP)-1^16,17. Vi har funnet ut at IL-17A og RORα-avhengige medfødte lymfoide celler er viktige bidragsytere til patogenesen i denne modellen¹⁸.

En stor komplikasjon av CD er dysregulated og overdreven deponering av ekstracellulære Matrix (ECM) inkludert kollagen^2,19. Selv om gi luftveiene har en relativt høy kapasitet for regenerering, antifibrotiske arrdannelse kan oppstå på grunn av uløste sår healing svar som er forbundet med kroniske og alvorlige betennelser^20,21. I CD, dette resulterer i skadelige effekter på vev arkitektur fører til betydelig organ svekkelse^21,22. Den transmuralt natur betennelse observert i CD til slutt forut for tykkere tarmveggen forbundet med symptomatisk stenose eller striktur formasjon²¹. Om lag en tredjedel av CD-pasienter krever intestinal reseksjon for denne komplikasjon²². Det er ingen effektive anti-antifibrotiske terapier i IBD gitt at bruk av immunsuppressive midler som azatioprin eller anti-TNFα biologiske har ingen innvirkning eller bare beskjedent redusert kravet om kirurgiske inngrep^19,23 . Mens fibrose er antatt være konsekvensen av kronisk betennelse, celler av mesenchymal opprinnelse som fibroblaster og pericytes antas å være den primære cellulære kilder til ECM i antifibrotiske arr^21,24. Kronisk S. Tyfimurium ΔAroA infeksjon er en robust musen modell av intestinal fibrose det kanne tilbud innblikk i patogenesen av CD-like vise egenskaper.

Protocol

Alle dyre protokoller ble godkjent av Animal Care Committee ved University of British Columbia. 1. utarbeidelse av Salmonella tyfimurium ΔAroA kulturer for oral gavage av mus Fra en frossen glyserol av S. Tyfimurium ΔAroA, klargjør en strek plate ved hjelp av LB agar som inneholder 100 μg/mL Streptomycin med en steril vaksinere sløyfe. Ruge over natten ved 37 ° c. Strek plater kan oppbevares inntil en uke ved 4 ° c. En dag før infeksjon forbereder …

Representative Results

Streptomycin behandling etterfulgt av oral infeksjon med S. Tyfimurium ΔAroA fører til robust tarmbetennelse og fibrose spesielt i cecum (figur 1). Typiske patogen byrder på 108 til 109 CFU per 1 g cecum og 104 CFU per 1 g milt kan utvinnes fra infiserte dyr (figur 2). Vurdering av fibrose i picrosirius rød beiset cecal seksjoner indikerer topp fibrose 21 dager etter smitte, mens mye av patologi er løst etter dag 42…

Discussion

Vår forståelse av patogenesen av IBD har blitt kraftig forsterket av musen modeller av intestinal betennelse. Selv om slike individuelle modeller ikke recapitulate alle funksjonene i komplekse og multifaktoriell menneskelig sykdom, har de vært nyttige i å identifisere viktige funksjoner i sykdomsprogresjon. Antifibrotiske strictures assosiert med IBD fortsatt en stor unmet klinisk behov som dagens behandlinger er ineffektive i reversering sykdomsutvikling. Videre, intestinal fibrose er vanskelig å studere i et labor…

Materials

2 ml round bottom safe lock tubes	Eppendorf	22363344
Stainless steel beads	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
Large-Orifice Pipet Tips	Fisher	2707134
2 mL megablock plates	Sarstedt	82.1972.002
Gavage needles	FST	18061-22
Streptomycin sulfate	Sigma	S9137
Mixer mill	Retsch	MM