Kronisk salmonella infektion inducerad intestinal fibros

Summary

Detta protokoll beskriver en musmodell av salmonella driven intestinal fibros som liknar viktiga patologiska kännetecken för Crohns sjukdom inklusive transmural inflammation och fibros. Denna metod kan användas för att utvärdera värd faktorer som förändrar fibrotiska resultat med muterade möss upprätthålls på en C57Bl/6 genetisk bakgrund.

Abstract

Vävnad fibros kännetecknas av patologiska ansamling av extracellulär matris såsom kollagen är resultatet av ihållande inflammation och dysreglerad reparation. Vid inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) leder fibros till återkommande striktur formationer för vilka det inte finns någon effektiv behandling annat än kirurgisk resektion. På grund av dess sena debut, de processer som driver fibros är mindre studeras och till stor del okända. Därför, fibrotiska komplikationer utgör en stor utmaning i IBD. I detta protokoll beskrivs en robust in vivo-modell av intestinal fibros där streptomycin förbehandling av C57Bl/6-möss följt av oral Sonda med vaccin klass salmonella typhimurium ΔAroA Mutant leder till ihållande patogen kolonisering och fibros i blindtarmen. Metoder för beredning av S. Typhimurium ΔAroA för ympning, kvantifiering av patogen laster i blindtarmen och mjälte, och utvärdera kollagen deposition i tarm vävnader förklaras. Denna experimentella sjukdoms modell är användbar för att undersöka värd faktorer som antingen förstärker eller förvärerar CD-liknande tarm fibros.

Introduction

Ulcerös kolit (UC) och Crohns sjukdom (CD) är de två stora formerna av IBD och kännetecknas som kroniska och^{skovvis inflammatoriska}sjukdomar i mag-tarmkanalen ^1,2. Dessa sjukdomar har en stor inverkan på livskvaliteten för patienter. Symtom på IBD inkluderar buksmärtor, diarré, illamående, viktminskning, feber, och trötthet³. Nyligen genomförda studier har identifierat genetiska och miljömässiga faktorer som bidrar till sjukdomens patogenes; Det är tänkt att sådana riskfaktorer bidrar till störningen av epitelbarriären vilket resulterar i flyttning eller översampling av luminala antigener⁴. Som en följd, detta initierar en avvikande inflammatorisk reaktion på kommensaler Flora medierad av intestinala immunceller⁴. Dragen av IBD-associerade komplikationer kan utsträckas till platser bortom mag-tarmkanalen påverkar olika organ inklusive leder, hud, och lever^1,2. Kännetecken av UC inkluderar svår och diffus inflammation typiskt lokaliserad i tjocktarmen¹. Sjukdoms patologi påverkar slemhinnan och submucosa i tarmen vilket resulterar i ytliga slemhinnor ulcerationer¹. Däremot kan CD påverka någon del av magtarmkanalen även om tecken på sjukdom är vanligt förekommande i tjocktarmen och distala ileum². Dessutom, inflammationen i CD är transmural, påverkar alla skikt av tarmväggen².

Flera IBD känslighet gener som har identifierats skulle tyda på att dysreglering av epitelbarriären eller immunitet är kritiska bidragande till sjukdomsprogression⁵. Mutationer i nukleotid oligomerisering domän 2 (NOD2) uttryckt av monocyter konstaterades vara förknippade med ökad känslighet för CD; Detta belyser en koppling mellan förändrad medfödda immun upptäckt av bakteriella komponenter och sjukdomen⁶. Nyare genomomfattande Associations studier (GWAS) har avslöjat ytterligare vägar som kan vara involverade i patogenesen för IBD, inklusive genetiska variationer hos: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R beroende vägar kopplad till adaptiv immunitet , MUC1, MUC19, och PTGER4 i tarmbarriären underhåll, och ATG16L-medierad autofagi^7,8,9. Medan dessa populationsbaserade genetik studier har förstärkt vår förståelse av IBD, känslighet alleler ensamt är sannolikt otillräckliga för att initiera och upprätthålla kronisk sjukdom³. Andra icke-genetiska faktorer inklusive förändringar i Gut mikrobiomet sammansättning och en minskning av mångfalden har förknippats med intestinal inflammation. Emellertid, det är oklart om gut dysbios föregår eller är följden av dysreglerade immunsvar³. Även etiologin av IBD förblir oklar, vår förståelse av patogenesen av sjukdomen har förbättrats genom experimentella musmodeller av tarminflammation^10,11. Dessa modeller representerar inte helt komplexiteten hos den mänskliga sjukdomen, men de är värdefulla för att belysa patofysiologiska vägar som kan vara relevanta för IBD och för validering av preliminära terapeutiska strategier^{10, 11}. Sådana musmodeller förlitar sig vanligtvis på initiering av inflammation genom kemisk induktion eller infektion, immun cells överföring, eller genetisk manipulation. Dessutom, dessa strategier involverar ofta störningar i epitelial integritet eller modulering av medfödd eller adaptiv immunitet.

Salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar är intestinala patogener som kan infektera människor och möss. Efter intag, salmonella kan kolonisera tarmen genom direkt invasion av epitelia, M celler, eller antigen presenterande celler¹². Möss infekterade oralt med S. Typhimurium resultat i koloniseringen främst av systemiska platser såsom mjälte och mesenteriska lymfkörtlar med relativt lågt överflöd i magtarmkanalen¹². Emellertid, förbehandling av möss med streptomycin ökar effektiviteten av salmonella kolonisering av tarmen genom att minska värd skyddande effekterna av den normala bakterieflora¹³. Patologiska funktioner i denna modell inkluderar störning eller sår av epitelbarriären, granulocyt rekrytering, och svår ödem¹³. Alternativt, infektion med vaccin klass S. Typhimurium ΔAroA Mutant leder till kronisk kolonisering av blindtarmen och tjocktarmen som kvarstår upp till dag 40 efter infektion¹⁴. Den S. Typhimurium ΔAroA stam har en defekt i biosyntesen av aromatiska aminosyror; Detta gör den muterade stammen Avirulenta och kan utnyttjas som en mycket effektiv vaccin¹⁵. Oral infektion hos möss leder till en Th1-och Th17-cytokin associerade inflammatoriska svar, omfattande vävnad remodeling, och kollagen deposition. Vävnads patologi är förknippad med förhöjda nivåer av Pro-fibrotiska faktor såsom TGF-β1, CTGF, och IGF¹⁴. Den transmural fibrotiska ärrbildning rapporteras i denna modell påminner om striktur formationer ofta observerats i IBD. Induktion av fibros genom salmonella kräver virulens kodat av salmonella pathogenicitetsöar (SPI)-1 och 2 ¹². Viktigt, detta S. Tymphimurium ΔAroA infektion modell är ett användbart system för studiet av fibrotiska svar i muterade möss upprätthålls på en C57/Bl6 bakgrund. C57/Bl6-stammen är extremt känslig för S. Typhiumurim SL1344 infektion på grund av en förlust-av-funktion mutation i genen kodning av naturliga resistensassocierade makrofagprotein (nramp)-1^16,17. Vi har funnit att Il-17a och rorα-beroende medfödda lymfoida celler är viktiga bidragande till patogenes i denna modell¹⁸.

En stor komplikation av CD är den dysreglerade och överdriven deposition av extracellulära matrix (ECM) inklusive kollagen^2,19. Även om magtarmkanalen har en relativt hög kapacitet för förnyelse, fibrotisk ärrbildning kan uppstå på grund av olösta sårläkning svar som är förknippade med kronisk och svår inflammation^20,21. I CD, detta resulterar i skadliga effekter på vävnads arkitektur leder till betydande organskada^21,22. Den transmural karaktären av inflammationen observerats i CD i slutändan föregår förtjockning av tarmväggen i samband med symtomatisk stenos eller striktur formation²¹. Om en tredjedel av CD-patienter kräver intestinal resektion för denna komplikation²². Det finns inga effektiva anti-fibrotiska terapier i IBD med tanke på att användningen av immunsuppressiva medel såsom azatioprin eller anti-TNFα Biologics inte har någon effekt eller endast blygsamt minskat behovet av kirurgiska ingrepp^19,23 . Medan fibros är tänkt vara följden av kronisk inflammation, celler av mesenkymala ursprung såsom fibroblaster och pericyter tros vara den primära cellulära källor av ECM i fibrotisk ärrbildning^21,24. Kronisk S. Typhimurium ΔAroA infektion är en robust musmodell av intestinal fibros som kan erbjuda insikter i patogenesen av CD-liknande funktioner.

Protocol

Alla djur protokoll godkändes av djur hälso nämnden vid University of British Columbia. 1. beredning av salmonella typhimurium ΔAroA kulturer för oral Sonning av möss Från en fryst glycerol lager av S. Typhimurium δaroa, Förbered en strimma plattan med lb agar som innehåller 100 μg/ml streptomycin med en steril vaccinera loop. Inkubera över natten vid 37 ° c. Strimma plattor kan förvaras upp till en vecka vid 4 ° c. En dag före infektionen,…

Representative Results

Behandling med streptomycin följt av oral infektion med S. Typhimurium ΔAroA leder till robust tarminflammation och fibros särskilt i blindtarmen (figur 1). Typiska patogen bördor på 108 till 109 CFU per 1 g blindtarmen och 104 CFU per 1 g mjälte kan återvinnas från smittade djur (figur 2). Bedömning av fibros i picrosirius röd färgade cecal avsnitt indikerar topp fibros 21 dagar efter infektion medan mycket a…

Discussion

Vår förståelse av patogenesen för IBD har förbättrats kraftigt genom musmodeller av tarminflammation. Även om sådana enskilda modeller inte recapitulate alla funktioner i komplexa och multifaktoriell mänskliga sjukdomen, de har varit användbara för att identifiera viktiga funktioner i sjukdomsprogression. Fibrotiska strikturer i samband med IBD förblir ett stort icke tillgodosedda kliniskt behov eftersom nuvarande behandlingar är ineffektiva i att vända sjukdomsutveckling. Dessutom är intestinal fibros sv?…

Materials

2 ml round bottom safe lock tubes	Eppendorf	22363344
Stainless steel beads	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
Large-Orifice Pipet Tips	Fisher	2707134
2 mL megablock plates	Sarstedt	82.1972.002
Gavage needles	FST	18061-22
Streptomycin sulfate	Sigma	S9137
Mixer mill	Retsch	MM