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Biochemistry

Caracterización de agregados de proteínas individuales por nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica

Published: September 12, 2019
doi:
10.3791/60108
, , , ,
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry,University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center,Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics,University of Cambridge

Summary

Describimos la aplicación de nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica de alta resolución para visualizar el proceso de autoensamblaje de proteínas en agregados oligoméricos y fibrillas amiloideas, que está estrechamente asociada con el inicio y desarrollo de una amplia gama de trastornos neurodegenerativos humanos.

Abstract

El fenómeno del desdoblamiento de proteínas y la agregación da como resultado la formación de agregados proteicos altamente heterogéneos, que se asocian con condiciones neurodegenerativas como el Alzheimer y las enfermedades de Parkinson. En particular, los agregados de bajo peso molecular, oligómeros amiloide, han demostrado poseer propiedades citotóxicas genéricas y están implicados como neurotoxinas en muchas formas de demencia. Ilustramos el uso de métodos basados en la microscopía de fuerza atómica (AFM) para abordar la difícil tarea de caracterizar las propiedades morfológicas, estructurales y químicas de estos agregados, que son difíciles de estudiar utilizando la estructura convencional métodos biofísicos a granel debido a su heterogeneidad y naturaleza transitoria. Los enfoques de microscopía de sonda de escaneo ahora son capaces de investigar la morfología de los agregados amiloide con resolución subnanómetro. Aquí mostramos que la nanoespectroscopia infrarroja (IR) (AFM-IR), que explota simultáneamente la alta resolución de AFM y el poder de reconocimiento químico de la espectroscopia IR, puede ir más allá y permitir la caracterización de las propiedades estructurales de proteínas y, por lo tanto, ofrecen información sobre los mecanismos de agregación. Dado que el enfoque que describimos se puede aplicar también a las investigaciones de las interacciones de los conjuntos de proteínas con moléculas pequeñas y anticuerpos, puede proporcionar información fundamental para desarrollar nuevos compuestos terapéuticos para diagnosticar o tratar trastornos neurodegenerativos.

Introduction

Más de 40 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas actualmente por trastornos neurodegenerativos, como el Alzheimer (AD)1 y las enfermedades de Parkinson (PD)2. En términos más generales, más de cincuenta patologías se asocian a nivel molecular con el desdoblamiento y la agregación de proteínas, un proceso que conduce a la proliferación de agregados de proteínas fibrilares insolubles, conocidos como depósitos amiloide3, 4. Los orígenes moleculares de la neurodegeneración y sus vínculos con los cambios conformacionales proteicos de las proteínas que conducen a la formación de amiloide, sin embargo, siguen sin estar claros, en gran parte debido al alto nivel de heterogeneidad, naturaleza transitoria y nanoescala dimensiones de los agregados patológicos4,5.

Investigaciones de gran éxito de las estructuras proteicas en las últimas décadas se han basado ampliamente en el uso de métodos a granel, incluyendo cristalografía de rayos X, microscopía crioelectrónica y espectroscopia de resonancia magnética nuclear5, 6 , 7 , 8 , 9. Dentro de esta clase de técnicas, la espectroscopia infrarroja (IR) ha surgido como una herramienta analítica sensible para desentrañar las propiedades químicas de sistemas biológicos como las proteínas8. Los métodos IR permiten cuantificar los cambios estructurales secundarios y cuaternarios de proteínas durante su desdoblamiento y agregación. Además, con el fin de descifrar aún más a nivel microscópico los detalles mecanicistas involucrados en los complejos paisajes de energía libre de proteínas durante su agregación, un avance importante ha sido el desarrollo de herramientas químicas cinéticas para extender a caminos de autoensamblaje incluyendo la formación de fibrillas amiloideas5,6,7,10,11,12. Sin embargo, los métodos espectroscópicos a granel proporcionan sólo información media sobre el conjunto heterogéneo de especies presentes en la solución o involucradas en pasos microscópicos específicos, lo que hace que la investigación de las propiedades biofísicas de especies agregadas desafiantes en el nivel de nanoescala13,14.

Varias técnicas de microscopía con la capacidad de operar en escalas más pequeñas que el límite de difracción de luz han surgido en las últimas décadas. Esta clase de métodos incluye microscopía electrónica (EM) y microscopía de fuerza atómica (AFM). Mientras que la microscopía electrónica de barrido (SEM) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporcionan imágenes bidimensionales (2D) de una muestra, AFM ha surgido en las últimas décadas como una técnica poderosa y versátil para estudiar morfologías tridimensionales (3D), como morfologías tridimensionales (3D), como así como las propiedades nanomecánicas de una muestra con resolución subnanómetro13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. La razón de ser del estudio de la agregación de proteínas a través de AFM es que este enfoque permite la investigación de la morfología de las especies individuales presentes en la solución13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. En particular, mediante el seguimiento de la muestra en función del tiempo, AFM permite la investigación de la evolución de la morfología de la especie dentro de la muestra, lo que permite seguir y visualizar las vías de formación de amiloide23, 25,38,39,40,41,42. Además, AFM permite la cuantificación de parámetros estructurales como las alturas transversales y longitudes de las especies individuales presentes en la solución13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. Sin embargo, el estudio de una sola propiedad biofísica, como la morfología, a menudo no es suficiente cuando se estudian sistemas biológicos heterogéneos y complejos. Los métodos de imágenes AFM, SEM o TEM por sí solos no revelan fácilmente las propiedades químicas de las especies heterogéneas de agregados amiloide a nanoescala.

Recientemente se ha realizado un importante avance para el análisis de muestras biológicas heterogéneas a esta escala con el desarrollo y la aplicación en el campo de la agregación proteica de la nanoespectroscopia infrarroja (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Este innovador método aprovecha la combinación de la resolución espacial de AFM (1 x 10 nm) con el poder de análisis químico de IR. La técnica AFM-IR se basa en la medición del efecto de resonancia inducida fototérmica impulsada por un láser IR, y en la medición de la expansión térmica de la muestra bajo investigación por la punta del AFM. La muestra puede ser iluminada por el láser IR directamente desde la parte superior o desde la parte inferior en la reflexión interna total, de forma similar a la de la espectroscopia infrarroja convencional24,42,52,53 . El láser IR se puede pulsada con frecuencias típicas en el orden de cientos de kilohercios (1-1000 kHz) y sintonizado en un amplio rango espectral, típicamente entre 1000-3300 cm-1. Aunque la fuente láser cubre un área de 30 m de diámetro, la resolución espacial de la técnica AFM-IR está determinada nominalmente por el diámetro de la punta AFM, que detecta la expansión térmica local del sistema. AFM-IR es muy adecuado para estudiar muestras biológicas porque la señal IR es proporcional a su espesor de hasta 1 x 1,5 m, y los espectros IR resultantes son generalmente de acuerdo con los espectros de transmisión FTIR correspondientes13,54 ,55. Por esta razón, los métodos establecidos de análisis en espectroscopia se pueden aplicar fácilmente, como el estudio de los cambios químicos, el cambio de forma de la banda y la desconvolución mediante el análisis de derivados segundo52. En general, combinando la resolución espacial de AFM con el poder de reconocimiento químico de la espectroscopia IR, AFM-IR permite la adquisición simultánea de una amplia gama de propiedades morfológicas, mecánicas y químicas de una muestra a nanoescala.

Aquí, ilustramos un protocolo para la caracterización del proceso de agregación de proteínas que explota la combinación de ensayos de fluorescencia in vitro, imágenes AFM de alta resolución y AFM-IR a nanoescala. Este enfoque combinado ya ha sobresalido en proporcionar resultados detallados en el estudio de las propiedades químicas y estructurales de las microgotas individuales formadas por agregados proteicos, en el estudio de la separación de fase sin proteínas líquidas y líquidas, y en investigando la heterogeneidad y las propiedades biofísicas de las especies agregadas individuales a la nanoescala23,26,38,45,50,53, 56,57.

Protocol

1. Ensayos de agregación en lectores de placas de fluorescencia NOTA: El protocolo descrito aquí es un ejemplo de cómo estudiar la agregación de cualquier proteína o péptido por cinética química. En particular, describe un protocolo optimizado para estudiar la agregación del péptido A-42, que participa en la aparición y progresión de la enfermedad de Alzheimer58,59. Un protocolo similar puede ser ajustado y adoptado para estu…

Representative Results

En la Figura 1se muestra un curso de tiempo representativo de la agregación A-42, medido por el ensayo de fluorescencia ThT. El proceso de agregación se caracteriza comúnmente por una curva sigmoidal, donde se observa inicialmente una fase de retraso, y es seguida por una fase de crecimiento pronunciada, antes de que la curva alcance una meseta cuando se alcanza un estado estacionario de equilibrio6,7 , <sup class="xref…

Discussion

El primer paso crítico en este protocolo es la preparación de proteínas monoméricas, como en el caso de la solución A-42 descrita en los pasos 1.1 y 1.2. Es esencial iniciar el proceso de agregación a partir de una solución monomérica altamente pura, ya que la presencia de especies oligoméricas o agregadas puede dar lugar a una mala reproducibilidad de la cinética de agregación58,e inducir artefactos en el AFM medidas (por ejemplo, especies fibrilares serán evidentes en las etapas inic…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Swiss National Foundation for Science (SNF) el apoyo financiero (número de subvención P2ELP2_162116 y P300P2_171219), el Darwin College, el programa Erasmus+ para el apoyo financiero (número de subvención 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) y el programa de apoyo financiero (número de subvención 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) y el programa de subvención la investigación que ha dado lugar a estos resultados ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación en el marco del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (7PM/2007-2013) a través de la beca PhysProt (acuerdo número 337969), la Fundación Newman (T.P.J.K.) y La Beca PhysProt (acuerdo número 337969), la Fundación Newman (T.P.J.K.) y La Centro de Cambridge para Enfermedades deSdoblamiento (C.G., M.V. y T.P.J.K.).

Materials

AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001
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Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).
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