מיקרו-הפיצול האנושי של רקמת אדיפוז לפנוטיפים של תאים ואפיון
Summary
. בעזרת מכשיר מערכת סגור שיטה חדשה זו מאפשרת בידור של אשכולות תת-מילימטר של רקמת האדיפוז המתאימים להשתלה vivo, בתרבות החוץ-גופית ובבידוד תאים נוסף ואפיון.
Abstract
במהלך העשור האחרון, השתלות רקמה באמצעות שימוש נרחב בכירורגיה פלסטית ובאורתופדיה כדי לשפר את הרקמה החוזרת של רקמות ו/או התחדשות. לפיכך, טכניקות לקציר ועיבוד של רקמת השומן האנושית התפתחו כדי להשיג במהירות וביעילות כמויות גדולות של רקמות. בין השאר, טכנולוגיית המערכת הסגורה מייצגת מערכת חדשנית וקלה לשימוש כדי לקצור, לעבד ולהזריק מחדש את רקמת השומן המעודנת בזמן קצר ובאותה התערבות (בשיתוף פעולה). רקמת אדיפוז נאסף על ידי שאיבת שומן, שטף, אמולסיה, שטיפת ובטחון מכני לתוך אשכולות תאים של 0.3 כדי 0.8 מ”מ. השתלת אוטוולוגי של רקמת אדיפוז בצורה מכנית הראתה יעילות יוצאת דופן בטיפולי שונות אינדיקציות כגון רפואה אסתטית וניתוח, אורתופדיה וניתוח כללי. אפיון מיקרו-רקמה מפוצלת חשף את נוכחותם של כלי קטן ללא פגע בתוך אשכולות האדיפוציטים; ולכן, הנישה הפריסקולרית נותרה לא מודאג. אשכולות אלה מועשרים בתאי וסקולריים (כלומר, תא גזע mesenchymal (MSC) אבות) ובניתוח חוץ גופית הראה שחרור מוגבר של גורמי גדילה וציטוקינים מעורבים תיקון רקמות והתחדשות, לעומת MSCs נגזר אנזימטי. הדבר מצביע על כך שהפוטנציאל הטיפולי המעולה של רקמת השומן המפוצלים מוסבר בתדירות גבוהה יותר של שוערת MSCs ופעילות הפרשה המשופרת. בין אם הוספת קרום הלב הוסיף במישרין לגורם גדילה גבוה יותר וייצור ציטוקין אינו ידוע. זו הליך מאושר קליני מאפשר השתלת שוערת MSCs ללא צורך התרחבות ו/או טיפול אנזימטי, ובכך לעקוף את הדרישות של הנחיות GMP, וצמצום העלויות עבור טיפולים מבוססי תאים.
Introduction
ברקמת אדיפוז, שימוש ממושך כמילוי בניתוחים קוסמטיים, הפכה לאחרונה לפופולרית יותר ברפואת ההתחדשות המוכרת כמקור לתאי גזע mesenchymal (MSCs)1. ליפופוטים הנתק אנזימטי לתוך תא יחיד השעיות בהספקויות התשואה של מסטרומה ללא שימוש מרובה וסקולרית (SVF) המשמשת בלתי מחולקת במטופל או, בדרך כלל, היא תרבותית במשך מספר שבועות לתוך MSCs2.
עם זאת, דיסוציאציה האנזים מרוכל את מיקרוסביבות הרקמה, secluding תאים הרגולציה השכנה מתאי משובי שוערת הפכו שונה במידה ניכרת על ידי תרבות מבחנה. כדי למנוע ממצאים ניסיוניים כאלה ושינויים פונקציונליים הסוגר, נעשו ניסיונות לעבד את רקמת האדיפוז לשימוש טיפולית תוך שמירה על התצורה הטבעית שלה בשלמותה ככל האפשר3,4. בעיקר, הפרעה ברקמה המכנית החלה להחליף את הדיסוציאציה האנזימטית. למטרה זו, מערכת סגורה טבילה מלאה מיקרו שברי ליפוף לתוך תת מילימטר, דם ושמן אשכולות רקמות (g., ליפופיטים) באמצעות רצף של סינון מסננת ושיבוש פלדה שיש מושרה3. השתלת אוטוולוגי של רקמת אדיפוז מקוטעת, באמצעות טכנולוגיית מערכת סגורה זו, הצליחה במספר רב של סימנים, מוצרי קוסמטיקה מורחבים, אורטופדיה, פרוטולוגיה ו גינקולוגיה4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
השוואה בין מיקרו-רקמת השומן האנושי מפוצל (MAT) המתקבל עם התקן מערכת סגורה ואיזוגניים SVF חשף כי ביחס כלי דם/סטרומה הפצת תאים ופעילות הפרשה בתרבות, MAT מכיל יותר קרום הלב, אשר שוערת MSCs14, ו מפריש כמויות גבוהות יותר של גורמי צמיחה ציטוקינים15.
המאמר הנוכחי ממחיש את הפיצול נטול האנזימים של רקמת השומן התת עורית האנושית באמצעות מכשיר מערכת סגור, והעיבוד הנוסף של רקמת השומן המיקרובית הזאת לתרבות החוץ-גופית, ניתוח האימונוהיסטוכימיה ו-FACS, על מנת לזהות את סוגי התאים הקיימים ואת הגורמים המוסיסים (איור 1). השיטה המתוארת יוצרת באופן בטוח שיטת האדיפוז משני מילימטר המכיל אוכלוסיות של תאים בעלי שומן קיימא בנישה שלמה, המתאימה ליישומים ולמחקרים נוספים.
Protocol
Representative Results
Discussion
נייר זה מתאר את המהומה הפיזית, באמצעות התקן מערכת סגור, של רקמת השומן האנושית לאשכולות קטנים המציגים מיקרואנטומיה רגילה של רקמת השומן.
באופן ידני מרעיף רקמה תת עורית ותמיסת מלח מלוחים לתוך גליל פלסטיק שקוף המכיל כדורים גדולים בסגנון פינבול מתכתי כי, על ניעור נמרץ של המכשיר, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות קלייר Cryer ו פיונה רוסי באוניברסיטת אדינבורו על הסיוע המומחים שלהם עם הזרימה cy, לנסות. אנו גם רוצים להודות לאנשי בית החולים Murrayfield שתרמו על ידי מתן דגימות רקמה.
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של קרן הלב הבריטית וליפואבני חן, אשר סיפק ערכות עיבוד רקמה ברקמת אדיפוז. דגימות רקמה של מבוגרים אנושיים הושגו עם הרשאת אתיקה מלאה של ועדת האתיקה של דרום מזרח סקוטלנד מחקר (התייחסות: 16/SS/0103).
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- . Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
