Summary

Tessuto Adiposo Umano Microframmentazione per la Fenotipizzazione Cellulare e la Caratterizzazione del Secretome

Published: October 20, 2019
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Summary

Qui, presentiamo micro-frammentazione senza enzimi adiposi umani utilizzando un dispositivo di sistema chiuso. Questo nuovo metodo consente l’ottenimento di ammassi sub-millimetrici di tessuto adiposo adatto per il trapianto in vivo, la coltura in vitro e l’ulteriore isolamento e caratterizzazione delle cellule.

Abstract

Nell’ultimo decennio, i trapianti di tessuto adiposo sono stati ampiamente utilizzati nella chirurgia plastica e nell’ortopedia per migliorare la riproduzione e/o la rigenerazione dei tessuti. Di conseguenza, le tecniche per la raccolta e la lavorazione del tessuto adiposo umano si sono evolute al fine di ottenere rapidamente ed efficientemente grandi quantità di tessuto. Tra questi, la tecnologia del sistema chiuso rappresenta un sistema innovativo e facile da usare per raccogliere, elaborare e reiniettare tessuto adiposo raffinato in breve tempo e nello stesso intervento (intraoperatorio). Il tessuto adiposo viene raccolto mediante liposuzione, lavato, emulsionato, sciacquato e sciacquato meccanicamente in grappoli cellulari da 0,3 a 0,8 mm. Il trapianto autologo di tessuto adiposo frammentato meccanicamente ha dimostrato una notevole efficacia in diverse terapie terapeutiche come la medicina estetica e la chirurgia, la chirurgia ortopedica e generale. La caratterizzazione del tessuto adiposo micro-frammentato ha rivelato la presenza di piccoli vasi intatti all’interno degli ammassi adipociti; quindi, la nicchia perivascolare rimane imperturbata. Questi ammassi sono arricchiti in cellule perivascolari (ad esempio, antenati delle cellule staminali mesenchymal (MSC)) e l’analisi in vitro ha mostrato un maggiore rilascio di fattori di crescita e citochine coinvolte nella riparazione e rigenerazione dei tessuti, rispetto alle MSC di degenerazione enzimaticamente. Ciò suggerisce che il potenziale terapeutico superiore del tessuto adiposo microframmentato è spiegato da una maggiore frequenza di MSC presuntivi e una maggiore attività secretoria. Non è noto se questi periciti aggiunti contribuiscano direttamente a un fattore di crescita più elevato e alla produzione di citochine. Questa procedura clinicamente approvata consente il trapianto di sOTT SONdativi senza la necessità di espansione e/o trattamento enzimatico, aggirando così i requisiti delle linee guida GMP e riducendo i costi per le terapie basate sulle cellule.

Introduction

Tessuto adiposo, a lungo utilizzato come riempitivo in chirurgia ricostruttiva e estetica, è recentemente diventato più popolare nella medicina rigenerativa una volta riconosciuto come fonte per le cellule staminali mesenchymiche (MSC)1. I lipoaspirati dissociati enzimati in sospensioni unicellulari producono una frazione vascolare stromale senza adipociti (SVF) che viene utilizzata inalterata nel paziente o, più comunemente, viene coltivata per diverse settimane in MSC2.

Tuttavia, la dissociazione enzimatica rompe i microambienti tissutali, appartando le cellule regolatorie vicine da cellule rigenerative presunte che diventano notevolmente modificate dalla coltura in vitro. Per evitare tali artefatti sperimentali e conseguenti alterazioni funzionali, sono stati fatti tentativi di elaborare il tessuto adiposo per uso terapeutico, pur mantenendo la sua configurazione nativa il più intatta possibile3,4. In particolare, l’interruzione meccanica dei tessuti ha iniziato a sostituire la dissociazione enzimatica. A tal fine, la full immersion ha chiuso i micro-frammenti di micro-frammenti lipoaspirati in sottomillimetri, cluster di tessuti privi di sangue e olio (ad esempio, Lipogems) attraverso una sequenza di filtrazione setaccio e marmo d’acciaio indotto interruzione3. Il trapianto autologo di tessuto adiposo micro-frammentato, utilizzando questa tecnologia di sistema chiuso, ha avuto successo in molteplici indicazioni, estendendo cosmetici, ortopedici, proctologia e ginecologia4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.

Il confronto tra il tessuto adipose umano microframmentato (MAT) ottenuto con il dispositivo di sistema chiuso e la SVF isogenica ha rivelato che per quanto riguarda la distribuzione delle cellule vascolari/stromali e l’attività secretoria nella coltura, il MAT contiene più periciti, che sono presuntistativi MSC14, e secerne maggiori quantità di fattori di crescita e citochine15.

Il presente articolo illustra la microframmentazione senza enzimi del tessuto adiposo sottocutaneo umano utilizzando un dispositivo di sistema chiuso, e l’ulteriore elaborazione di tale tessuto adiposo micronizzato per la coltura in vitro, l’immunohistochimica e l’analisi FACS, per identificare i tipi di cellule presenti e i fattori solubili secreti (Figura 1). Il metodo descritto genera in modo sicuro organoidi sub-millimeter derivati adiposi contenenti popolazioni di cellule adipose vitali in una nicchia intatta, adatta per ulteriori applicazioni e studi.

Protocol

L’approvazione etica per l’uso dei tessuti umani in questa ricerca è stata ottenuta dal Comitato etico di ricerca del Sud-Est della Scozia (riferimento: 16/SS/0103). 1. Collezione di tessuti adiposi addominali sottocutanei NOT:</ Tutti gli strumenti utilizzati nella procedura manuale lipo-aspirazione sono forniti dal produttore del dispositivo di microframmentazione. Mantenere la sterilità per tutti i fluidi, contenitori, strumenti…

Representative Results

La dissociazione meccanica dei lipoaspiri manuali ha portato alla produzione di tessuto adiposo microframmentato (MAT), costituito da un aggregato di adipociti che avvolgevano una rete microvascolare (Figura 3). L’analisi dell’immunofluorescenza del MAT incorporato nella gelatina e criofissa evidenzia questa struttura, mostrando la rete vascolare contrassegnata dal marcatore di cellule endoteliali Ulex europaeus agglutinininina 1 (UEA-1) costituita principalm…

Discussion

Questo documento descrive la frazione fisica, utilizzando un dispositivo di sistema chiuso, del tessuto adiposo umano in piccoli ammassi che mostrano la normale microanatomia del tessuto adiposo.

Il tessuto adipose umano aspirato manualmente e la soluzione salina vengono caricati in un cilindro di plastica trasparente contenente grandi sfere metalliche in stile flipper che, a forte agitazione manuale del dispositivo, rompono il grasso in sub-millimetri Frammenti. I filtri attaccati e le slet c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Claire Cryer e Fiona Rossi dell’Università di Edimburgo per la loro assistenza esperta con citometria di flusso. Desideriamo anche ringraziare il personale dell’ospedale Murrayfield che ha contribuito fornendo campioni di tessuto.

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della British Heart Foundation e Lipogems, che hanno fornito kit di lavorazione dei tessuti adiposi. Campioni di tessuto umano adulto sono stati acquistati con il pieno permesso etico del Comitato etico di ricerca del Sud Est Scozia (riferimento: 16/SS/0103).

Materials

4% Buffered paraformaldehyde (PFA) VWR chemicals 9317.901
0.9% NaCl Solution Baxter 3KB7127
AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG  Life Technologies A21422
AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG Life Technologies  A21245
Ammonium chloride fisher chemicals 1158868
Antigent Diluent Life Technologies 3218
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus BD Biosciences 560497
Avidin/Biotin Blocking Kit Life Technologies 4303
BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer  BD Biosciences Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies 
Biotinylated Ulex europaeus lectin Vector Laboratories Vector-B1065
BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control BD Biosciences 563044
CD146-BV711 BD Biosciences 563186
CD31-V450 BD Biosciences 561653
CD34-PE BD Biosciences 555822
CD45-V450 BD Biosciences 560367
DAPI Life Technologies D1306 stock concentration: 5mg/mL
Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18)   Lipogems  provided in the Lipogems surgical kit
Diva software 306 (v.6.0) BD Biosciences
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate Life Technologies 61965026
EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM Lonza  CC-3156
Fetal Calf Serum (FCS) Sigma-Aldrich F2442
FlowJo (v.10.0) FlowJo
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
Gelatin Acros Organics 410870025
Lipogems Surgical Kit Lipogems  LG SK 60
Mouse anti human- NG2 BD Biosciences 554275 stock concentration: 0.5 mg/mL
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555749
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap  BD Biosciences 352235, 25/Pack
Polystyrene round bottom 5 mL tubes BD Biosciences 352003
Rabbit anti human – PDGFRb Abcam 32570 stock concentration: 0.15 mg/mL
Streptavidin conjugated-488 Life Technologies  S32354
Sucrose Sigma-Aldrich 84100-5kg
Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)  Lipogems  provided in the Lipogems surgical kit
Tris base fisher chemicals BP152-500
Type- II Collagenase Gibco 17101-015
V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 560373
Widefield Zeiss observer Zeiss Objective used: Plan-Apo 20x/0.8
Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) Zeiss DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;  555: Green, excitation 555nm;  647:Red, excitation 630nm 

References

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Cite This Article
Vezzani, B., Gomez-Salazar, M., Casamitjana, J., Tremolada, C., Péault, B. Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization. J. Vis. Exp. (152), e60117, doi:10.3791/60117 (2019).

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