Menselijke vetweefsel micro-fragmentatie voor Celfenotyping en Secretome karakterisatie
Summary
Hier presenteren we menselijke vetweefsel enzym-vrije micro-fragmentatie met behulp van een gesloten systeem apparaat. Deze nieuwe methode maakt het verkrijgen van sub-millimeter clusters van vetweefsel geschikt voor in vivo transplantatie, in vitro cultuur, en verdere celisolatie en karakterisering.
Abstract
In het afgelopen decennium zijn vetweefsel transplantaties op grote schaal gebruikt in plastische chirurgie en orthopedie om weefsel repletie en/of regeneratie te verbeteren. Dienovereenkomstig zijn technieken voor het oogsten en verwerken van menselijk vetweefsel geëvolueerd om snel en efficiënt grote hoeveelheden weefsel te verkrijgen. Onder deze, de gesloten systeemtechnologie vertegenwoordigt een innovatief en eenvoudig te gebruiken systeem om te oogsten, te verwerken, en opnieuw te injecteren verfijnd vetweefsel in een korte tijd en in dezelfde interventie (intra-operatief). Vetweefsel wordt opgevangen door liposuctie, gewassen, geëmulgeerd, gespoeld en machinaal fijngehakt in celclusters van 0,3 tot 0,8 mm. autologe transplantatie van mechanisch gefragmenteerd vetweefsel heeft opmerkelijke werkzaamheid aangetoond bij verschillende therapeutische indicaties zoals esthetische geneeskunde en chirurgie, orthopedische en algemene chirurgie. Karakterisering van micro-gefragmenteerd vetweefsel onthulde de aanwezigheid van intacte kleine vaten binnen de adipocyten clusters; Vandaar, de perivasculaire niche blijft onperturbed. Deze clusters zijn verrijkt in perivasculaire cellen (dat wil zeggen, mesenchymale stamcel (MSC) voor ouders) en in vitro analyse toonde een verhoogde afgifte van groeifactoren en cytokines die betrokken zijn bij weefselherstel en regeneratie, vergeleken met enzymatisch afgeleide MSCs. Dit suggereert dat het superieure therapeutische potentieel van micro gefragmenteerd vetweefsel wordt verklaard door een hogere frequentie van vermoedelijke MSCs en verbeterde secretoire activiteit. Of deze toegevoegde pericytes rechtstreeks bijdragen aan een hogere groeifactor en de productie van cytokine is niet bekend. Deze klinisch goedgekeurde procedure maakt de transplantatie van vermoedelijke MSCs mogelijk zonder de noodzaak van expansie en/of enzymatische behandeling, waardoor de vereisten van de GMP-richtlijnen worden omzeild en de kosten voor cel-gebaseerde therapieën worden verminderd.
Introduction
Vetweefsel, lang gebruikt als een vuller in reconstructieve en cosmetische chirurgie, is onlangs populairder geworden in regeneratieve geneeskunde, ooit herkend als een bron voor mesenchymale stamcellen (MSCs)1. Lipoaspiraten gezien enzymatisch in eencellige suspensies opleveren een adipocyte-vrije stromale vasculaire fractie (SvF) die ongewijzigd wordt gebruikt in de patiënt of, meer in het algemeen, wordt gekweekt voor enkele weken in MSCS2.
Echter, enzym dissociatie breekt de weefsel micro-omgevingen, afzondering naburige regelgevende cellen van vermoedelijke regeneratieve cellen die aanzienlijk worden gewijzigd door in vitro cultuur. Om dergelijke experimentele artefacten en de daaruit voortvloeiende functionele veranderingen te vermijden, zijn pogingen gedaan om vetweefsel te verwerken voor therapeutisch gebruik, terwijl de oorspronkelijke configuratie zo intact mogelijk was3,4. Met name, mechanische weefsel verstoring is begonnen met het vervangen van enzymatische dissociatie. Hiertoe, de volledige onderdompeling gesloten systeem micro-fragmenten lipoaspirates in sub-millimeter, bloed-en olievrije weefsel clusters (bijvoorbeeld Lipogems) via een opeenvolging van zeef filtratie en staal marmer geïnduceerde verstoring3. Autologe transplantatie van micro-gefragmenteerd vetweefsel, met behulp van deze gesloten systeemtechnologie, is succesvol geweest in meerdere indicaties, spanning van cosmetica, orthopedie, Proctologie en Gynaecologie4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Vergelijking tussen humaan micro-gefragmenteerd vetweefsel (MAT) verkregen met het gesloten systeem apparaat en isogene SVF onthulde dat met betrekking tot de vasculaire/stromale celverdeling en secretoire activiteit in cultuur, MAT meer pericytes bevat, die vermoedelijke MSCs14, en afscheidigt hogere hoeveelheden groeifactoren en cytokines15.
Het huidige artikel illustreert de enzym vrije micro fragmentatie van menselijk subcutaan vetweefsel met behulp van een gesloten systeem apparaat, en de verdere verwerking van dergelijk gemicroniseerd vetweefsel voor in vitro cultuur, immunohistochemie en FACS analyse, om de aanwezige celtypen te identificeren en de oplosbare factoren te scheiden (Figuur 1). De beschreven methode genereert veilig vetweefsel afgeleide sub-millimeter organoïden met levensvatbare vetweefsel celpopulaties in een intacte niche, geschikt voor verdere toepassingen en studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft de fysieke fractionering, met behulp van een gesloten systeem apparaat, van menselijke vetweefsel in kleine clusters weergeven van normale vetweefsel micro anatomie.
Handmatig aanzuiging menselijk onderhuidse vetweefsel en zoutoplossing worden geladen in een transparante plastic cilinder met grote flipperkast-achtige metalen bollen die, na krachtig handmatig schudden van het apparaat, het vet in sub-millimeter breken Fragmenten. Bijgevoegde filters en uitlaat maken het e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Claire Cryer en Fiona Rossi van de Universiteit van Edinburgh bedanken voor hun deskundige hulp bij Flow Cytometry. We willen ook het personeel van het Murrayfield-ziekenhuis bedanken, dat bijgedragen heeft aan het verstrekken van weefsel specimens.
Dit werk werd gesteund door subsidies van de British Heart Foundation en Lipogems, die vetweefsel processing kits leverde. Menselijke weefselmonsters voor volwassenen werden verkregen met volledige ethische toestemming van het onderzoek ethisch comité van Zuidoost-Schotland (Referentie: 16/SS/0103).
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- . Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
