सेल फेनोटाइपिंग और सेलेग्नोम विशेषता के लिए मानव वसा ऊतक सूक्ष्म विखंडन
Summary
यहाँ, हम मानव वसा ऊतक एंजाइम मुक्त सूक्ष्म विखंडन एक बंद प्रणाली डिवाइस का उपयोग कर प्रस्तुत करते हैं. इस नई विधि विवो प्रत्यारोपण में के लिए उपयुक्त वसा ऊतक के उप मिलीमीटर समूहों की प्राप्ति की अनुमति देता है, इन विट्रो संस्कृति में, और आगे सेल अलगाव और विशेषता.
Abstract
पिछले दशक में, वसा ऊतक प्रत्यारोपण व्यापक रूप से प्लास्टिक सर्जरी और आर्थोपेडिक्स में इस्तेमाल किया गया है ऊतक repletion और / तदनुसार, मानव वसा ऊतक की कटाई और प्रसंस्करण के लिए तकनीक विकसित की है ताकि जल्दी और कुशलता से ऊतक की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए. इनमें से, बंद प्रणाली प्रौद्योगिकी फसल के लिए एक अभिनव और आसान करने के लिए उपयोग प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है, प्रक्रिया, और फिर से एक कम समय में और एक ही हस्तक्षेप में परिष्कृत वसा ऊतक सुई (इंट्रा ऑपरेटिव). वसा ऊतक liposuction द्वारा एकत्र किया जाता है, धोया, पायसी, कुल्ला और 0.3 से 0.8 मिमी के सेल समूहों में यांत्रिक रूप से कीमा बनाया. यांत्रिक रूप से खंडित वसा ऊतक के Autologous प्रत्यारोपण विभिन्न चिकित्सकीय में उल्लेखनीय प्रभावकारिता दिखाया गया है इस तरह के सौंदर्य चिकित्सा और सर्जरी, आर्थोपेडिक और सामान्य सर्जरी के रूप में संकेत। सूक्ष्म-खंडित वसा ऊतक की विशेषता से एडिपोसाइट समूहों के भीतर बरकरार छोटे जहाजों की उपस्थिति का पता चला; इसलिए, पेरिवास्कुलर आला unperturbed छोड़ दिया है. इन समूहों perivascular कोशिकाओं में समृद्ध कर रहे हैं (यानी, mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) पूर्वजों) और इन विट्रो विश्लेषण में विकास कारकों और ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन में शामिल cytokines की वृद्धि हुई रिहाई से पता चला, एंजाइमी रूप से व्युत्पन्न MSCs की तुलना में. यह पता चलता है कि microfragmented वसा ऊतक के बेहतर चिकित्सीय क्षमता अनुमानित एमएससी और बढ़ाया स्रावी गतिविधि की एक उच्च आवृत्ति द्वारा समझाया गया है. क्या इन जोड़ा pericytes सीधे उच्च विकास कारक में योगदान और cytokine उत्पादन ज्ञात नहीं है. इस चिकित्सकीय अनुमोदित प्रक्रिया के विस्तार और / या एंजाइमी उपचार की आवश्यकता के बिना अनुमानित एमएससी के प्रत्यारोपण की अनुमति देता है, इस प्रकार जीएमपी दिशा निर्देशों की आवश्यकताओं को दरकिनार, और सेल आधारित चिकित्सा के लिए लागत को कम करने.
Introduction
वसा ऊतक, लंबे पुनर्निर्माण और कॉस्मेटिक सर्जरी में एक भराव के रूप में इस्तेमाल किया, हाल ही में एक बार mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (एमएससी)1के लिए एक स्रोत के रूप में मान्यता प्राप्त पुनर्योजी चिकित्सा में अधिक लोकप्रिय हो गया है। Lipoaspirates एक सेल निलंबन में enzymaticly अलग एक adipocyte मुक्त stromal संवहनी अंश (SVF) है कि रोगी में unaltered प्रयोग किया जाता है या, अधिक सामान्यतः, एमएससी2में कई हफ्तों के लिए सुसंस्कृत है उपज.
हालांकि, एंजाइम वियोजन ऊतक microenvironments टूटता है, अनुमानित पुनर्योजी कोशिकाओं है कि काफी इन विट्रो संस्कृति में द्वारा संशोधित हो से पड़ोसी नियामक कोशिकाओं को अलग. इस तरह के प्रयोगात्मक कलाकृतियों और परिणामस्वरूप कार्यात्मक परिवर्तन से बचने के लिए, चिकित्सीय उपयोग के लिए वसा ऊतक को संसाधित करने के प्रयास किए गए हैं, जबकि इसके मूल विन्यास को यथासंभव बरकरार रखने के लिए3,4. विशेष रूप से, यांत्रिक ऊतक विघटन एंजाइमी वियोजन को बदलने के लिए शुरू कर दिया है। इस अंत में, पूर्ण विसर्जन बंद प्रणाली सूक्ष्म टुकड़े lipoaspirates उप मिलीमीटर में, रक्त और तेल मुक्त ऊतक समूहों (जैसे, Lipogems) छलनी निस्पंदन और इस्पात संगमरमर प्रेरित व्यवधान के एक दृश्य के माध्यम से3. सूक्ष्म खंडित वसा ऊतक के ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण, इस बंद प्रणाली प्रौद्योगिकी का उपयोग कर, कई संकेतों में सफल रहा है, सौंदर्य प्रसाधन फैले, आर्थोपेडिक्स, प्रोक्टोलॉजी और स्त्री रोग4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
मानव सूक्ष्म-खंडित वसा ऊतक (मैट) के बीच तुलना बंद प्रणाली डिवाइस और isogenic SVF के साथ प्राप्त पता चला है कि संवहनी / अनुमानित एमएससी14, और वृद्धि कारकों और साइटोकिन्स15की अधिक मात्रा का स्राव करता है .
वर्तमान लेख एक बंद प्रणाली डिवाइस का उपयोग कर मानव subcutaneous वसा ऊतक के एंजाइम मुक्त सूक्ष्म विखंडन दिखाता है, और इन विट्रो संस्कृति, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और FACS विश्लेषण के लिए इस तरह के micronized वसा ऊतक के आगे प्रसंस्करण, वर्तमान सेल प्रकारों और घुलनशील कारकों की पहचान करने के लिए (चित्र 1)। वर्णित विधि सुरक्षित रूप से एक बरकरार आला में व्यवहार्य वसा ऊतक कोशिका आबादी युक्त वसा व्युत्पन्न उप मिलीमीटर organoids उत्पन्न करता है, आगे अनुप्रयोगों और अध्ययन के लिए उपयुक्त.
Protocol
Representative Results
Discussion
यह कागज शारीरिक प्रभाजन का वर्णन करता है, एक बंद प्रणाली डिवाइस का उपयोग कर, मानव वसा ऊतक के छोटे समूहों में सामान्य वसा ऊतक microanatomy प्रदर्शित.
मैन्युअल रूप से aspirated मानव subcutaneous वसा ऊतक और नमकीन समाध?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के प्रवाह cytometry के साथ अपने विशेषज्ञ सहायता के लिए एडिनबर्ग विश्वविद्यालय में क्लेयर Cryer और Fiona Rossi शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. हम मर्रेफील्ड अस्पताल के उन कर्मियों को भी धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने ऊतक नमूने प्रदान करके योगदान दिया।
यह काम ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन और Lipogems, जो वसा ऊतक प्रसंस्करण किट की आपूर्ति से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. मानव वयस्क ऊतक नमूने दक्षिण पूर्व स्कॉटलैंड अनुसंधान आचार समिति की पूर्ण नैतिकता की अनुमति के साथ खरीद रहे थे (संदर्भ: 16/
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
References
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