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Bioengineering

圧力筋グラフを用したマウス生殖系の二軸基底音と受動的試験

Published: August 13, 2019
doi:
10.3791/60125
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Tulane University

Summary

このプロトコルは、市販の圧力ミオグラフシステムを利用して、マウス膣および子宮頸部の圧力筋グラフ試験を行った。カルシウムの有無にかかわらず培地を利用して、平滑筋細胞(SMC)基底色および受動細胞外マトリックス(ECM)の寄与は、推定生理学的条件下で臓器に対して単離された。

Abstract

女性の生殖器官、特に膣および子宮頸部は、様々な細胞成分とユニークな細胞外マトリックス(ECM)で構成されている。平滑筋細胞は、膣および頸部壁内の収縮機能を示す。生化学的環境と臓器壁の機械的膨張に応じて、平滑筋細胞は収縮状態を変化させる。ベースライン生理条件下での平滑筋細胞の寄与は、基底トーンとして分類される。より具体的には、基底トーンは、ホルモンおよび神経刺激がない場合の平滑筋細胞のベースライン部分収縮である。さらに、ECMは器官の壁のための構造サポートを提供し、生化学的手がかりのための貯蔵所として機能する。これらの生化学的手がかりは、成長を刺激し、恒常化を維持するなど、様々な臓器機能に不可欠です。各器官のECMは、主にコラーゲン繊維(主にコラーゲンタイプI、III、およびV)、弾性繊維、およびグリコサミノグリカン/プロテオグリカンで構成されています。ECMの組成および組織は、各器官の機械的特性を決定する。ECM組成物の変化は、骨盤臓器脱出や早期子宮頸部改造などの生殖病理学の発症につながる可能性がある。さらに、ECM微細構造および剛性の変化は、平滑筋細胞活性および表現型を変化させ、したがって収縮力の喪失をもたらす。

この研究では、報告されたプロトコルは、妊娠していないマウス膣および子宮頸部の基底トーンおよび受動的な機械的特性を、エストラスの生後4〜6ヶ月で評価するために使用される。器官は市販の圧力ミオグラフに取り付けられ、圧力直径および力長の両方のテストが行われた。生殖器官の機械的特徴付けのためのサンプルデータおよびデータ分析技術が含まれる。このような情報は、数学的モデルを構築し、女性の健康病理のための治療介入を合理的に設計するのに役立つ可能性があります。

Introduction

膣壁は、上皮、層体プロプリア、筋肉、およびアドベンティシアの4つの層で構成されています。上皮は、主に上皮細胞から構成される。ラミナプロプリアは、弾性およびフィブリルコラーゲン繊維を大量に有する。筋肉はまた、エラスチンとコラーゲン繊維で構成されていますが、平滑筋細胞の量が増加しています。このアドベンティシアは、前の層と比較して濃度が低下するが、エラスチン、コラーゲン、および線維芽細胞で構成される。平滑筋細胞は、臓器の収縮性の役割を果たしているので、生体力学的に動機づけられた研究グループに関心があります。そのため、平滑筋細胞領域分画と組織を定量化することは、機械的機能を理解する上で重要である。以前の研究は、膣壁内の平滑筋含有量が主に円周軸と縦軸で組織されたことを示唆している。組織学的分析は、平滑筋領域の分率が壁1の近位部および遠位部の両方に対して約35%であることを示唆している。

子宮頸部は非常にコラーゲン構造であり、最近まで、平滑筋細胞含有量を最小限に抑えるものと考えられていた2,3.しかし、最近の研究は、平滑筋細胞が子宮頸部4、5においてより多くの存在と役割を持つことが示唆されている。子宮頸部は、平滑筋細胞の勾配を示す。内部osは、外部osが10%しか含まれている50-60%の平滑筋細胞が含まれています。しかし、マウス研究は、10〜15%の平滑筋細胞と85〜90%の線維性結合組織で構成される子宮頸部を報告し、局所的な差は言及しない6、7、8である。マウスモデルが頻繁に報告されるヒトモデルと異なっていることを考えると、マウス子宮頸部に関するさらなる調査が必要である。

このプロトコルの目的は、マウス膣および子宮頸部の機械的特性を解明することであった。これは、ネイティブの細胞マトリックス相互作用と器官形状を維持しながら、円周方向と軸方向の機械的特性の評価を同時に可能にする圧力筋グラフ装置を使用することによって達成されました。器官は2つのカスタムカニューレに取付けられ、絹の6-0縫合糸で固定された。圧力直径試験は、推定生理軸ストレッチの周りに行われ、コンプライアンスおよび接線モジュリ9を決定した。力長試験は、推定軸伸縮性を確認し、機械的特性が生理学的範囲で定量化されたことを確認するために行われた。実験プロトコルは、妊娠4~6ヶ月の妊娠4~6ヶ月で非妊娠マウス膣および子宮頸部に対して行われた。

プロトコルは、基礎音と受動試験の2つの主要な機械試験セクションに分かれています。基底トーンは、滑筋細胞のベースライン部分収縮として定義され、外部局所、ホルモン、および神経刺激10が存在しない場合でも。膣および子宮頸部のこのベースライン収縮性は、その後圧力筋グラフシステムによって測定される特徴的な機械的挙動をもたらす。受動的特性は、収縮のベースライン状態を維持する細胞間カルシウムを除去することによって評価され、平滑筋細胞の弛緩をもたらす。受動的な状態では、コラーゲンおよびエラスチン繊維は、器官の機械的特性に対する支配的な寄与を提供する。

マウスモデルは、女性の生殖健康の病理を研究するために広く使用されています。マウスは、生殖システム11、12、13、14内のECMと機械的特性との間の進化する関係を定量化するためのいくつかの利点を提供する。これらの利点は、短く、よく特徴付けられたエストルースサイクル、比較的低コスト、取り扱いの容易さ、および比較的短い妊娠時間15を含む。さらに、実験用マウスのゲノムは十分にマッピングされ、遺伝子組み換えマウスは、機械的仮説16、17、18をテストするための貴重なツールである。

市販の圧力ミオグラフシステムは、様々な組織や器官の機械的応答を定量するために広く使用されています。圧力筋グラフシステムで分析されたいくつかの注目すべき構造は、弾性動脈19、20、21、22、静脈および組織工学的血管移植片23、24、を含む食道25、および大腸26。圧力筋グラフ技術は、ネイティブセルECM相互作用と生体内ジオメトリを維持しながら、軸方向と周囲方向の特性を同時に評価することを可能にします。軟部組織および臓器力学におけるミオグラフシステムの広範な使用にもかかわらず、圧力ミオグラフ技術を利用するプロトコルは、これまで膣および子宮頸部のために開発されていなかった。膣および子宮頸部の機械的特性に関する以前の調査は、単一軸27、28を評価した。しかし、これらの器官は、体内で多軸負荷を経験し、従って、その二軸機械的応答を定量化することが重要である。

さらに、最近の研究は、平滑筋細胞が軟部組織病理5、28、31、32において潜在的な役割を果たす可能性があることを示唆している。これは、ネイティブの細胞マトリックス相互作用を維持するので、圧力筋グラフ技術を利用するもう一つの魅力を提供し、したがって、平滑筋細胞が生理学的および病態生理学的に果たす貢献の線引きを可能にする条件。本明細書では、基底音と受動条件の両方下で膣および子宮頸部の多軸機械的特性を定量するプロトコルを提案する。

Protocol

この研究には、エストラウスにおける4〜6ヶ月メスC57BL6Jマウス(29.4±6.8グラム)を用いた。すべての手順は、トゥレーン大学の研究所動物ケアと使用委員会によって承認されました.分娩後、マウスは安楽死の1週間前に順応し、標準的な条件下で収容された(12時間の光/暗いサイクル)。 1. エストラスでのマウスの犠牲 エストルースサイクルを決定する:エストルース?…

Representative Results

女性の生殖器官の機械的特性の正常な分析は、適切な臓器解剖、カンヌレーション、およびテストに依存しています。子宮角を欠陥なく膣に植え付ける必要がある(図1)。臓器の種類によってカニューレの大きさが異なります(図2)。実験中に臓器が動くだけでなく、処置中に器官の壁を損傷しないように、カンヌレーションを行う必要があります(図3…

Discussion

この記事で提供されるプロトコルは、マウス膣および子宮頸部の機械的特性を決定する方法を提示する。このプロトコルで分析される機械的特性は、器官の受動的および基底調素状態の両方を含む。受動的および基底トーン条件は、器官が水没する生化学的環境を変化させることによって誘発される。このプロトコルでは、基底試験に関与する媒体にはカルシウムが含まれています。基底ト?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NSFキャリア賞助成金#1751050によって資金提供されました。

Materials

2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer – 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors
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White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).
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