Tono Basal Biaxial y Pruebas Pasivas del Sistema Reproductivo Murino Usando un Miógrafo de Presión
Summary
Este protocolo utilizó un sistema de miógrafo de presión disponible comercialmente para realizar pruebas de miógrafo de presión en la vagina murina y el cuello uterino. Utilizando medios con y sin calcio, las contribuciones del tono basal de las células musculares lisas (SMC) y la matriz extracelular pasiva (ECM) se aislaron para los órganos en condiciones fisiológicas estimadas.
Abstract
Los órganos reproductores femeninos, específicamente la vagina y el cuello uterino, se componen de varios componentes celulares y una matriz extracelular única (ECM). Las células musculares lisas exhiben una función contráctea dentro de las paredes vaginales y cervicales. Dependiendo del entorno bioquímico y la distensión mecánica de las paredes del órgano, las células musculares lisas alteran las condiciones contráctas. La contribución de las células musculares lisas en condiciones fisiológicas basales se clasifica como un tono basal. Más específicamente, un tono basal es la constricción parcial basal de las células musculares lisas en ausencia de estimulación hormonal y neuronal. Además, el ECM proporciona soporte estructural para las paredes de los órganos y funciona como un reservorio para señales bioquímicas. Estas señales bioquímicas son vitales para varias funciones del órgano, como incitar al crecimiento y mantener la homeostasis. El ECM de cada órgano se compone principalmente de fibras de colágeno (principalmente tipos de colágeno I, III y V), fibras elásticas y glicosaminoglicanos/proteoglicanos. La composición y organización del ECM dicta las propiedades mecánicas de cada órgano. Un cambio en la composición de la ECM puede conducir al desarrollo de patologías reproductivas, como el prolapso de órganos pélvicos o la remodelación cervical prematura. Además, los cambios en la microestructura y rigidez de ECM pueden alterar la actividad celular muscular lisa y el fenotipo, lo que resulta en la pérdida de la fuerza contráctea.
En este trabajo, los protocolos reportados se utilizan para evaluar el tono basal y las propiedades mecánicas pasivas de la vagina de la murina no embarazada y el cuello uterino a los 4-6 meses de edad en estrus. Los órganos se montaron en un miógrafo de presión disponible comercialmente y se realizaron pruebas de diámetro de presión y de longitud de fuerza. Se incluyen datos de muestra sin muestras y técnicas de análisis de datos para la caracterización mecánica de los órganos reproductivos. Dicha información puede ser útil para construir modelos matemáticos y diseñar racionalmente intervenciones terapéuticas para las patologías de salud de las mujeres.
Introduction
La pared vaginal se compone de cuatro capas, el epitelio, lamina propria, muscularis, y adventitia. El epitelio se compone principalmente de células epiteliales. La lámina propria tiene una gran cantidad de fibras elásticas y fibrilares de colágeno. El muscularis también se compone de fibras de elastina y colágeno, pero tiene una mayor cantidad de células musculares lisas. La adventitia se compone de elastina, colágeno y fibroblastos, aunque en concentraciones reducidas en comparación con las capas anteriores. Las células musculares lisas son de interés para los grupos de investigación biomecánicos motivados, ya que juegan un papel en la naturaleza contráctea de los órganos. Como tal, cuantificar la fracción de área muscular lisa y la organización es clave para entender la función mecánica. Investigaciones anteriores sugieren que el contenido muscular liso dentro de la pared vaginal está organizado principalmente en el eje circunferencial y longitudinal. El análisis histológico sugiere que la fracción de área muscular lisa es aproximadamente 35% para las secciones proximal y distal de la pared1.
El cuello uterino es una estructura altamente colágeno, que hasta hacepoco, se pensaba que tenía un contenido mínimo de células musculares lisas 2,3. Estudios recientes, sin embargo, han sugerido que las células musculares lisas pueden tener una mayor abundancia y papel en el cuello uterino4,5. El cuello uterino presenta un gradiente de células musculares lisas. El os interno contiene 50-60% células musculares lisas donde el os externo sólo contiene 10%. Estudios de ratón, sin embargo, reportan que el cuello uterino está compuesto de 10-15% células musculares lisas y 85-90% tejido conectivo fibroso sin mención de diferencias regionales6,7,8. Dado que el modelo de ratón difiere del modelo humano frecuentemente reportado, se necesitan más investigaciones sobre el cuello uterino del ratón.
El propósito de este protocolo era dilucidar las propiedades mecánicas de la vagina murina y el cuello uterino. Esto se logró mediante el uso de un dispositivo miógrafo de presión que permite la evaluación de las propiedades mecánicas en las direcciones circunferenciales y axiales simultáneamente, manteniendo las interacciones célula-matriz nativas y la geometría de órganos. Los órganos se montaron en dos cánulas personalizadas y se aseguraron con suturas de seda 6-0. Se realizaron pruebas de diámetro de presión alrededor del estiramientoaxial fisiológico estimado para determinar el cumplimiento y el mínimo tangente 9. Se realizaron pruebas de longitud de fuerza para confirmar el estiramiento axial estimado y para asegurar que las propiedades mecánicas se cuantificaran en el rango fisiológico. El protocolo experimental se realizó en la vagina murina no embarazada y el cuello uterino a los 4-6 meses de edad en estrus.
El protocolo se divide en dos secciones principales de pruebas mecánicas: tono basal y pruebas pasivas. Un tono basal se define como la constricción parcial basal de las células musculares lisas, incluso en ausencias de estimulación local, hormonal y neuronal externa10. Esta naturaleza contráctea basal de la vagina y el cuello uterino produce comportamientos mecánicos característicos que luego se miden por el sistema miógrafo de presión. Las propiedades pasivas se evalúan mediante la eliminación del calcio intercelular que mantiene el estado basal de contracción, lo que resulta en la relajación de las células musculares lisas. En el estado pasivo, las fibras de colágeno y elastina proporcionan las contribuciones dominantes para las características mecánicas de los órganos.
El modelo murino se utiliza ampliamente para estudiar patologías en la salud reproductiva de las mujeres. El ratón ofrece varias ventajas para cuantificar las relaciones en evolución entre eCM y las propiedades mecánicas dentro del sistema reproductivo11,12,13,14. Estas ventajas incluyen ciclos estrosos cortos y bien caracterizados, costo relativamente bajo, facilidad de manejo, y un tiempo gestacional relativamente corto15. Además, el genoma de los ratones de laboratorio es bien mapeado y los ratones modificados genéticamente son herramientas valiosas para probar hipótesis mecanicistas16,17,18.
Los sistemas de miógrafo a presión disponibles comercialmente se utilizan ampliamente para cuantificar las respuestas mecánicas de diversos tejidos y órganos. Algunas estructuras notables analizadas en el sistema de miógrafo de presión incluyen arterias elásticas19,20,21,22, venas e injertos vasculares de ingeniería de tejido23,24, el esófago25,y los intestinos gruesos26. La tecnología de miógrafo de presión permite la evaluación simultánea de las propiedades en las direcciones axial y circunferencial, manteniendo las interacciones celulares nativas y la geometría in vivo. A pesar del uso extensivo de sistemas de miógrafo en la mecánica de tejidos blandos y órganos, no se había desarrollado previamente un protocolo que utilizaba la tecnología de miógrafo de presión para la vagina y el cuello uterino. Se evaluaron las investigaciones previas sobre las propiedades mecánicas de la vagina y el cuello uterino uniaxialmente27,28. Estos órganos, sin embargo, experimentan carga multiaxial dentro del cuerpo29,30, por lo tanto cuantificar su respuesta mecánica biaxial es importante.
Por otra parte, trabajos recientes sugieren células musculares lisas pueden desempeñar un papel potencial en patologías de tejidos blandos5,28,31,32. Esto proporciona otra atracción de la utilización de la tecnología de miógrafo de presión, ya que preserva las interacciones célula-matriz nativas, permitiendo así la delineación de la contribución que las células musculares lisas juegan en fisiológica y fisiopatológica Condiciones. Aquí, proponemos un protocolo para cuantificar las propiedades mecánicas multiaxiales de la vagina y el cuello uterino tanto en el tono basal como en las condiciones pasivas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo proporcionado en este artículo presenta un método para determinar las propiedades mecánicas de la vagina murina y el cuello uterino. Las propiedades mecánicas analizadas en este protocolo incluyen las condiciones de tono pasivo y basal de los órganos. Las condiciones de tono pasivo y basal se inducen alterando el entorno bioquímico en el que el órgano está sumergido. Para este protocolo, los medios involucrados en las pruebas basales contienen calcio. La prueba de la condición del tono basal permite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La obra fue financiada por la concesión de la beca NSF CAREER #1751050.
Materials
| 2F catheter | Millar | SPR-320 | catheter to measure cervical pressure |
| 6-0 Suture | Fine Science Tools | 18020-60 | larger suture ties |
| CaCl2 (anhydrous) | VWR | 97062-590 | HBSS concentration: 140 mg/ mL |
| CaCl2-2H20 | Fischer chemical | BDH9224-1KG | KRB concentration: 3.68 g/L |
| Dextrose (D-glucose) | VWR | 101172-434 | HBSS concentration: 1000 mg/mL KRB concentration: 19.8 g/L |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | curved forceps |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | straight forceps |
| Eclipse | Nikon | E200 | microscope used for imaging |
| Flow meter | Danish MyoTechnologies | 161FM | flow meter within the testing apparatus |
| Force Transducer – 110P | Danish MyoTechnologies | 100079 | force transducer |
| ImageJ | SciJava | ImageJ1 | used to measure volume |
| Instrument Cases | Fine Science Tools | 20830-00 | casing to hold dissection tools |
| KCl | Fisher Chemical | 97061-566 | HBSS concentration: 400 mg/ mL KRB concentration: 3.5 g/L |
| KH2PO4 | G-Biosciences | 71003-454 | HBSS concentration: 60 mg/ mL |
| MgCl2 | VWR | 97064-150 | KRB concentration: 1.14 g/L |
| MgCl2-6H2O | VWR | BDH9244-500G | HBSS concentration: 100 mg/ mL |
| MgSO4-7H20 | VWR | 97062-134 | HBSS concentration: 48 mg/ mL |
| Mircosoft excel | Microsoft | 6278402 | program used for spreadsheet |
| Na2HPO4 (dibasic anhydrous) | VWR | 97061-588 | HBSS concentration: 48 mg/mL KRB concentration: 1.44 g/L |
| NaCl | VWR | 97061-274 | HBSS concentration: 8000 mg/mL KRB concentration: 70.1 g/L |
| NaHCO3 | VWR | 97062-460 | HBSS concentration: 350 mg/ mL KRB concentration: 21.0 g/L |
| Pressure myograph systems | Danish MyoTechnologies | 110P and 120CP | Pressure myograph system: prorgram, cannulation device, and controller unit |
| Pressure Transducer | Danish MyoTechnologies | 100106 | pressure transducer |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | straight forceps |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | micro-scissors |
| Tissue dye | Bradley Products | 1101-3 | ink to measure in vivo stretch |
| Ultrasound transducer | FujiFilm Visual Sonics | LZ-550 | ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency |
| VEVO2100 | FujiFilm Visual Sonics | VS-20035 | ultrasound used for imaging |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | larger scissors |
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