Biaxial basal ton och passiv testning av murina reproduktionssystemet med hjälp av en Tryckmyograph
Summary
Detta protokoll utnyttjas ett kommersiellt tillgängliga tryck myograph system för att utföra tryck myograph testning på murin slidan och livmoderhalsen. Använda Media med och utan kalcium, bidragen från den släta muskelceller (SMC) basal tonen och passiv extracellulära matrix (ECM) isolerades för organ under uppskattade fysiologiska förhållanden.
Abstract
De kvinnliga reproduktionsorganen, särskilt slidan och livmoderhalsen, består av olika cellulära komponenter och en unik extracellulär matris (ECM). Släta muskelceller uppvisar en kontraktila funktion inom vaginala och livmoderhals väggarna. Beroende på den biokemiska miljön och den mekaniska utspänd av orgel väggarna, de släta muskelcellerna förändra kontraktila villkor. Bidraget från de glatta muskelcellerna under baslinjen fysiologiska förhållanden klassificeras som en basal ton. Mer specifikt, en basala tonen är baslinjen partiell sammandragning av glattmuskelceller i avsaknad av hormonella och neurala stimulering. Dessutom ger ECM strukturellt stöd för orgel väggarna och fungerar som en reservoar för biokemiska signaler. Dessa biokemiska signaler är avgörande för olika organfunktioner, såsom anhållande tillväxt och upprätthålla homeostas. ECM av varje organ består främst av kollagenfibrer (mestadels kollagentyper I, III, och V), elastiska fibrer, och glykosaminoglykaner/proteoglykaner. Sammansättningen och organisationen av ECM diktera de mekaniska egenskaperna hos varje organ. En förändring i ECM sammansättning kan leda till utveckling av reproduktiva patologier, såsom bäcken orgel framfall eller för tidig cervikal remodeling. Vidare, förändringar i ECM mikrostruktur och stelhet kan förändra glatt muskulaturen cell aktivitet och fenotyp, vilket resulterar i förlusten av kontraktila kraft.
I detta arbete, de rapporterade protokollen används för att bedöma basala tonen och passiva mekaniska egenskaper hos den icke-gravida murina vagina och livmoderhalsen vid 4-6 månaders ålder i Estrus. Organen var monterade i en kommersiellt tillgänglig tryckmyograph och både tryck-diameter och kraft-längd tester utfördes. Exempeldata och dataanalys tekniker för mekanisk karakterisering av fortplantningsorganen ingår. Sådan information kan vara användbar för att konstruera matematiska modeller och rationellt utforma terapeutiska interventioner för kvinnors hälsorelaterade sjukdomar.
Introduction
Den vaginala väggen består av fyra skikt, epitelet, lamina propria, muscularis, och adventitia. Epitelet består främst av epitelceller. Den lamina propria har en stor mängd elastiska och fibrillar kollagenfibrer. Den muscularis hinna är också sammansatt av elastin och kollagenfibrer men har en ökad mängd glatta muskelceller. Adventitia består av elastin, kollagen, och fibroblaster, om än i reducerade koncentrationer jämfört med de tidigare lagren. De glatta muskelcellerna är av intresse för biomekaniskt motiverade forskargrupper som de spelar en roll i kontraktila karaktären av organen. Som sådan, kvantifiera smidig muskel cell Area fraktion och organisation är nyckeln till att förstå den mekaniska funktionen. Tidigare undersökningar tyder på att den släta muskel halt inom vaginalväggen är främst organiserad i omkretsriktningen och längsgående axeln. Histologisk analys tyder på att glatta muskel arean fraktion är cirka 35% för både proximala och distala delar av väggen1.
Livmoderhalsen är en mycket kollagenous struktur, som tills nyligen, ansågs ha minimal smidig muskel cellinnehåll2,3. Nyligen genomförda studier har dock föreslagit att släta muskelceller kan ha ett större överflöd och roll i livmoderhalsen4,5. Livmoderhalsen uppvisar en gradient av glatta muskelceller. Det interna operativsystemet innehåller 50-60% glatta muskelceller där det externa operativsystemet endast innehåller 10%. Mus studier, emellertid, rapportera livmoderhalsen som ska bestå av 10-15% glattmuskelceller och 85-90% fibrösa bindväv utan omnämnande av regionala skillnader6,7,8. Med tanke på att musmodellen skiljer sig från den ofta rapporterade mänskliga modellen, ytterligare undersökningar om mus livmoderhalsen behövs.
Syftet med detta protokoll var att belysa de mekaniska egenskaperna hos den murina slidan och livmoderhalsen. Detta åstadkoms med hjälp av en tryck myograph enhet som möjliggör bedömning av mekaniska egenskaper i omkretsriktningen och axiella riktningar samtidigt samtidigt som infödda cell-matris interaktioner och orgel geometri. Organen var monterade på två anpassade kanyl och säkrade med silke 6-0 suturer. Prov med tryck diameter utfördes runt den uppskattade fysiologiska axiala sträckningen för att fastställa efterlevnaden och tangent moduli9. Force-length tester utfördes för att bekräfta den uppskattade axiella sträckan och för att säkerställa att mekaniska egenskaper kvantifierades i det fysiologiska området. Den experimentella protokollet utfördes på den icke-gravida murina vagina och livmoderhalsen vid 4-6 månaders ålder i Estrus.
Protokollet är uppdelat i två huvudsakliga mekaniska provnings sektioner: basal ton och passiv testning. En basal ton definieras som baslinjen partiell sammandragning av glatta muskelceller, även i frånvaro av externa lokala, hormonella, och neurala stimulering10. Denna baslinje kontraktila karaktären av slidan och livmoderhalsen ger karakteristiska mekaniska beteenden som sedan mäts av trycket myograph systemet. De passiva egenskaperna bedöms genom att ta bort den intercellulära kalcium som upprätthåller baslinjen tillstånd av kontraktion, vilket resulterar i avslappning av glatta muskelceller. I det passiva tillståndet ger kollagen och elastin fibrer de dominerande bidragen för de mekaniska egenskaperna hos organen.
Den murina modellen används i stor utsträckning för att studera patologier i kvinnors reproduktiv hälsa. Musen erbjuder flera fördelar för att kvantifiera de föränderliga relationerna mellan ECM och mekaniska egenskaper inom reproduktionssystemet11,12,13,14. Dessa fördelar inkluderar korta och väl karaktäriserade brunst cykler, relativt låg kostnad, enkel hantering, och en relativt kort gestationstid15. Dessutom är genomet av laboratoriemöss väl kartlagda och genetiskt modifierade möss är värdefulla verktyg för att testa mekanistiska hypoteser16,17,18.
Kommersiellt tillgängliga tryck myograph system används i stor utsträckning för att kvantifiera de mekaniska svaren från olika vävnader och organ. Några anmärkningsvärda strukturer analyseras på trycket myograph systemet inkluderar elastiska artärer19,20,21,22, vener och vävnad konstruerade vaskulära ympkvistar23,24, matstrupen25, och de stora tarmarna26. Trycket myograph Technology tillåter samtidig bedömning av egenskaper i axiella och omkretsriktningen riktningar samtidigt som de infödda cell-ECM interaktioner och in vivo geometri. Trots den omfattande användningen av myograph system i mjuk vävnad och orgel mekanik, ett protokoll som utnyttjar trycket myograph Technology hade inte tidigare utvecklats för slidan och livmoderhalsen. Tidigare undersökningar av de mekaniska egenskaperna hos slidan och livmoderhalsen bedömdes uniaxially27,28. Dessa organ, dock uppleva multiaxiella lastning i kroppen29,30, vilket kvantifierar deras biaxiella mekaniska svar är viktigt.
Dessutom, nyligen arbete antyder glattmuskelceller kan spela en potentiell roll i mjuk vävnad patologier5,28,31,32. Detta ger en annan attraktion att utnyttja den tryck myograph teknik, eftersom det bevarar de infödda cell-matris interaktioner, vilket möjliggör avgränsning av bidraget att släta muskelceller spelar i fysiologiska och patofysiologiska Villkor. Häri föreslår vi ett protokoll för att kvantifiera de multiaxiella mekaniska egenskaperna hos slidan och livmoderhalsen under både basal tonen och passiva förhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som föreskrivs i denna artikel presenterar en metod för att bestämma de mekaniska egenskaperna hos murin slidan och livmoderhalsen. De mekaniska egenskaperna som analyseras i detta protokoll omfattar både de passiva och basala ton förhållandena i organen. Passiva och basala ton förhållanden induceras genom att förändra den biokemiska miljö där orgeln är nedsänkt. För detta protokoll innehåller media som deltar i basal testning kalcium. Testning av basal tonen tillstånd tillåter isolering a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet finansierades av NSF CAREER Award Grant #1751050.
Materials
| 2F catheter | Millar | SPR-320 | catheter to measure cervical pressure |
| 6-0 Suture | Fine Science Tools | 18020-60 | larger suture ties |
| CaCl2 (anhydrous) | VWR | 97062-590 | HBSS concentration: 140 mg/ mL |
| CaCl2-2H20 | Fischer chemical | BDH9224-1KG | KRB concentration: 3.68 g/L |
| Dextrose (D-glucose) | VWR | 101172-434 | HBSS concentration: 1000 mg/mL KRB concentration: 19.8 g/L |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | curved forceps |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | straight forceps |
| Eclipse | Nikon | E200 | microscope used for imaging |
| Flow meter | Danish MyoTechnologies | 161FM | flow meter within the testing apparatus |
| Force Transducer – 110P | Danish MyoTechnologies | 100079 | force transducer |
| ImageJ | SciJava | ImageJ1 | used to measure volume |
| Instrument Cases | Fine Science Tools | 20830-00 | casing to hold dissection tools |
| KCl | Fisher Chemical | 97061-566 | HBSS concentration: 400 mg/ mL KRB concentration: 3.5 g/L |
| KH2PO4 | G-Biosciences | 71003-454 | HBSS concentration: 60 mg/ mL |
| MgCl2 | VWR | 97064-150 | KRB concentration: 1.14 g/L |
| MgCl2-6H2O | VWR | BDH9244-500G | HBSS concentration: 100 mg/ mL |
| MgSO4-7H20 | VWR | 97062-134 | HBSS concentration: 48 mg/ mL |
| Mircosoft excel | Microsoft | 6278402 | program used for spreadsheet |
| Na2HPO4 (dibasic anhydrous) | VWR | 97061-588 | HBSS concentration: 48 mg/mL KRB concentration: 1.44 g/L |
| NaCl | VWR | 97061-274 | HBSS concentration: 8000 mg/mL KRB concentration: 70.1 g/L |
| NaHCO3 | VWR | 97062-460 | HBSS concentration: 350 mg/ mL KRB concentration: 21.0 g/L |
| Pressure myograph systems | Danish MyoTechnologies | 110P and 120CP | Pressure myograph system: prorgram, cannulation device, and controller unit |
| Pressure Transducer | Danish MyoTechnologies | 100106 | pressure transducer |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | straight forceps |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | micro-scissors |
| Tissue dye | Bradley Products | 1101-3 | ink to measure in vivo stretch |
| Ultrasound transducer | FujiFilm Visual Sonics | LZ-550 | ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency |
| VEVO2100 | FujiFilm Visual Sonics | VS-20035 | ultrasound used for imaging |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | larger scissors |
References
- Capone, D., et al. Evaluating Residual Strain Throughout the Murine Female Reproductive System. Journal of Biomechanics. 82, 299-306 (2019).
- Danforth, D. The fibrous nature of the human cervix, and its relation to the isthmic segment in gravid and nongravid uteri. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 53 (4), 541-560 (1947).
- Hughesdon, P. The fibromuscular structure of the cervix and its changes during pregnancy and labour. Journal of Obstetrics and Gynecology of the British Commonwealth. 59, 763-776 (1952).
- Bryman, I., Norstrom, A., Lindblo, B. Influence of neurohypophyseal hormones on human cervical smooth muscle cell contractility in vitro. Obstetrics and Gynecology. 75 (2), 240-243 (1990).
- Joy, V., et al. A New Paradigm for the Role of Smooth Muscle Cells in the Human Cervix. Obstetrics. 215 (4), e471-e478 (2016).
- Xu, X., Akgul, Y., Mahendroo, M., Jerschow, A. Ex vivo assessment of mouse cervical remodeling through pregnancy via Na (23) MRS. NMR Biomedical. 23 (23), 907-912 (2014).
- Leppert, P. Anatomy and Physiology of cervical ripening. Clinical Obstetrics and Gynecology. 43 (43), 433-439 (2000).
- Schlembach, D., et al. Cervical ripening and insufficiency: from biochemical and molecular studies to in vivo clinical examination. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 144, S70-S79 (2000).
- Stoka, K., et al. Effects of Increased Arterial Stiffiness on Atherosclerotic Plaque Amounts. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), (2018).
- Mohram, D., Heller, L. Ch. 7. Cardiovascular Physiology. , (2006).
- Yoshida, K., et al. Quantitative Evaluation of Collagen Crosslinks and Corresponding Tensile Mechanical Properties in Mouse Cervical Tissue during Normal Pregnancy. PLoS One. 9, e112391 (2014).
- Mahendroo, M. Cervical remodeling in term and preterm birth: insight from an animal model. Society for Reproduction and Fertility. 143 (4), 429-438 (2012).
- Elovitz, M., Miranlini, C. Can medroxyprogesterone acetate alter Toll-like receptor expression in a mouse model of intrauterine inflammation?. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 193 (3), 1149-1155 (2005).
- Ripperda, C., et al. Vaginal estrogen: a dual-edged sword in postoperative healing of the vaginal wall. North American Menopause Society. 24 (7), 838-849 (2017).
- Nelson, J., Felicio, P., Randall, K., Sims, C., Finch, E. A Longitudinal Study of Estrous Cyclicity in Aging C57/6J Mice: Cycle, Frequency, Length, and Vaginal Cytology. Biology of Reproduction. 27 (2), 327-339 (1982).
- Ferruzzi, J., Collins, M., Yeh, A., Humphrey, J. Mechanical assessment of elastin integrity in fibrillin-1-deficient carotid arteries: implications for Marfan Syndrome. Cardiovascular Research. 92 (2), 287-295 (2011).
- Mariko, B., et al. Fribrillin-1 genetic deficiency leads to pathological ageing of arteries in mice. The Journal of Pathology. 224 (1), 33-44 (2011).
- Rahn, D., Ruff, M., Brown, S., Tibbals, H., Word, R. Biomechanical Properties of The Vaginal Wall: Effect of Pregnancy, Elastic Fiber Deficiency, and Pelvic Organ Prolapse. American Urogynecological Society. 198 (5), (2009).
- Caulk, A., Nepiyushchikh, Z., Shaw, R., Dixon, B., Gleason, R. Quantification of the passive and active biaxial mechanical behavior and microstructural organization of rat thoracic ducts. Royal Society Interface. 12 (108), 20150280 (2015).
- Amin, M., Le, V., Wagenseil, J. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. Journal of Visualized Experiments. (60), e3733 (2012).
- Sokolis, D., Sassani, S., Kritharis, E., Tsangaris, S. Differential histomechanical response of carotid artery in relation to species and region: mathematical description accounting for elastin and collagen anisiotropy. Medical and Biological Engineering and Computing. 49 (8), 867-879 (2011).
- Kim, J., Baek, S. Circumferential variations of the mechanical behavior of the porcine thoracic aorta during the inflation test. Journal of Biomechanics. 44 (10), 1941-1947 (2011).
- Faury, G., et al. Developmental adaptation of the mouse cardiovascular system to elastin haploinsufficency. Journal of Clinical Investigation. 11 (9), 1419-1428 (2003).
- Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue-Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Engineering. 20, 346-355 (2014).
- Sommer, G., et al. Multaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).
- Sokolis, D., Orfanidis, I., Peroulis, M. Biomechanical testing and material characterization for the rat large intestine: regional dependence of material parameters. Physiological Measurement. 32 (12), 1969-1982 (2011).
- Martins, P., et al. Prediction of Nonlinear Elastic Behavior of Vaginal Tissue: Experimental Results and Model Formation. Computational Methods of Biomechanics and Biomedical Engineering. 13 (3), 317-337 (2010).
- Feola, A., et al. Deterioration in Biomechanical Properties of the Vagina Following Implantation of a High-stiffness Prolapse Mesh. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 120 (2), 224-232 (2012).
- Huntington, A., Rizzuto, E., Abramowitch, S., Prete, Z., De Vita, R. Anisotropy of the Passive and Active Rat Vagina Under Biaxial Loading. Annals of Biomedical Engineering. 47, 272-281 (2018).
- Tokar, S., Feola, A., Moalli, P., Abramowitch, S. Characterizing the Biaxial Mechanical Properties of Vaginal Maternal Adaptations During Pregnancy. ASME 2010 Summer Bioengineering Conference, Parts A and B. , 689-690 (2010).
- Feloa, A., et al. Impact of Pregnancy and Vaginal Delivery on the Passive and Active Mechanics of the Rat Vagina. Annals of Biomedical Engineering. 39 (1), 549-558 (2010).
- Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical Analysis of the Uterosacral Ligament: Swine vs Human. Annual Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
- Champlin, A. Determining the Stage of the Estrous Cycle in the Mouse by the Appearance. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
- Byers, S., Wiles, M., Dunn, S., Taft, R. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- McLean, A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. 67, e4389 (2012).
- Bugg, G., Riley, M., Johnston, T., Baker, P., Taggart, M. Hypoxic inhibition of human myometrial contractions in vitro: implications for the regulation of parturition. European Journal of Clinical Investigation. 36 (2), 133-140 (2006).
- Taggart, M., Wray, S. Hypoxia and smooth muscle function: key regulatory events during metabolic stress. Journal of Physiology. 509, 315-325 (1998).
- Yoo, K., et al. The effects of volatile anesthetics on spontaneous contractility of isolated human pregnant uterine muscle: a comparison among sevoflurane, desflurane, isoflurane, and halothane. Anesthesia and Analgesia. 103 (2), 443-447 (2006).
- de Souza, L., et al. Effects of redox disturbances on intentional contractile reactivity in rats fed with a hypercaloric diet. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 6364821 (2018).
- Jaue, D., Ma, Z., Lee, S. Cardiac muscarinic receptor function in rats with cirrhotic cardiomyopathy. Hepatology. 25, 1361-1365 (1997).
- Xu, Q., Shaffer, E. The potential site of impaired gallbladder contractility in an animal mode of cholesterol gallstone disease. Gastroenterology. 110 (1), 251-257 (1996).
- Rodriguez, U., et al. Effects of blast induced Neurotrauma on pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Visualized Experimentals. (146), e58792 (2019).
- Rubod, C., Boukerrou, M., Brieu, M., Dubois, P., Cosson, M. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue Part 1: New Experimental Protocol. Journal of Urology. 178, 320-325 (2007).
- Robison, K., Conway, C., Desrosiers, L., Knoepp, L., Miller, K. Biaxial Mechanical Assessment of the Murine Vaginal Wall Using Extension-Inflation Testing. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 104504 (2017).
- Van loon, P. Length-Force and Volume-Pressure Relationships of Arteries. Biorheology. 14 (4), 181-201 (1977).
- Fernandez, M., et al. Investigating the Mechanical Function of the Cervix During Pregnancy using Finite Element Models Derived from High Resolution 3D MRI. Computational Methods Biomechanical and Biomedical Engineering. 19 (4), 404-417 (2015).
- House, M., Socrate, S. The Cervix as a Biomechanical Structure. Ultrasound Obstetric Gynecology. 28 (6), 745-749 (2006).
- Martins, P., et al. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue in Women with Pelvic Organ Prolapse. Gynecologic and Obstetrics Investigation. 75, 85-92 (2013).
- Rada, C., Pierce, S., Grotegut, C., England, S. Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In vivo. Journal of Visualized Experiments. (98), e52541 (2015).
- Lumsden, M. A., Baird, D. T. Intra-uterine pressure in dysmenorrhea. Acta Obstectricia at Gynecologica Scandinavica. 64 (2), 183-186 (1985).
- Milsom, I., Andersch, B., Sundell, G. The Effect of Flurbiprofen and Naproxen Sodium On Intra-Uterine Pressure and Menstrual Pain in Patients With Primary Dysmennorrhea. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 67 (8), 711-716 (1988).
- Park, K., et al. Vasculogenic female sexual dysfunction: the hemodynamic basis for vaginal engorgement insufficiency and clitoral erectile insufficiency. International Journal of Impotence Journal. 9 (1), 27-37 (1997).
- Bulletti, C., et al. Uterine Contractility During Menstrual Cycle. Human Reproduction. 15, 81-89 (2000).
- Kim, N. N., et al. Effects of Ovariectomy and Steroid Hormones on Vaginal Smooth Muscle Contractility. International Journal of Impotence Research. 16, 43-50 (2004).
- Giraldi, A., et al. Morphological and Functional Characterization of a Rat Vaginal Smooth Muscle Sphincter. International Journal of Impotence Research. 14, 271-282 (2002).
- Gleason, R., Gray, S. P., Wilson, E., Humphrey, J. A Multiaxial Computer-Controlled Organ Culture and Biomechanical Device for Mouse Carotid Arteries. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (6), 787-795 (2005).
- Swartz, M., Tscumperlin, D., Kamm, R., Drazen, J. Mechanical Stress is Communicated Between Different Cell Types to Elicit Matrix Remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (11), 6180-6185 (2001).
- Rachev, A. Remodeling of Arteries in Response to Changes in their Mechanical Environment. Biomechanics of Soft Tissue in Cardiovascular Systems. 441, 221-271 (2003).
- Lee, E. J., Holmes, J., Costa, K. Remodeling of Engineered Tissue Anisotropy in Response to Altered Loading Conditions. Annals of Biomedical Engineering. 36 (8), 1322-1334 (2008).
- Akintunde, A., et al. Effects of Elastase Digestion on the Murine Vaginal Wall Biaxial Mechanical Response. Journal of Biomechanical Engineering. 141 (2), 021011 (2018).
- Griffin, M., Premakumar, Y., Seifalian, A., Butler, P., Szarko, M. Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
- Myers, K., Socrate, S., Paskaleva, A., House, M. A Study of the Anisotripy and Tension/Compression Behavior of Human Cervical Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 132 (2), 021003 (2010).
- Murtada, S., Ferruzzi, J., Yanagisawa, H., Humphrey, J. Reduced Biaxial Contractility in the Descending Thoracic Aorta of Fibulin-5 Deficent Mice. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (5), 051008 (2016).
- Berkley, K., McAllister, S., Accius, B., Winnard, K. Endometriosis-induced vaginal hyperalgesia in the rat: effect of estropause, ovariectomy, and estradiol replacement. Pain. 132, s150-s159 (2007).
- van der Walt, I., Bø, K., Hanekom, S., Rienhardt, G. Ethnic Differences in pelvic floor muscle strength and endurance in South African women. International Urogynecology Journal. 25 (6), 799-805 (2014).
