Biaxial बेसल टोन और Murine प्रजनन प्रणाली के निष्क्रिय परीक्षण एक दबाव मायोग्राफ का उपयोग
Summary
इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दबाव मायोग्राफ प्रणाली का उपयोग करने के लिए murine योनि और गर्भाशय ग्रीवा पर दबाव मायोग्राफ परीक्षण प्रदर्शन. कैल्शियम के साथ और बिना मीडिया का उपयोग, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (एसएमसी) बेसल टोन और निष्क्रिय extracellular मैट्रिक्स (ECM) के योगदान अनुमानित शारीरिक स्थितियों के तहत अंगों के लिए अलग थे.
Abstract
मादा प्रजनन अंग, विशेष रूप से योनि और गर्भाशय ग्रीवा, विभिन्न सेलुलर घटकों और एक अद्वितीय extracellular मैट्रिक्स (ईसीएम) से बना रहे हैं. चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं योनि और गर्भाशय ग्रीवा दीवारों के भीतर एक संकुचन समारोह प्रदर्शन. जैव रासायनिक वातावरण और अंग दीवारों के यांत्रिक तनाव पर निर्भर करता है, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं संकुचन शर्तों को बदल. आधारभूत शारीरिक स्थितियों के तहत चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के योगदान को बेसल टोन के रूप में वर्गीकृत किया गया है। अधिक विशेष रूप से, एक बेसल टोन हार्मोनल और तंत्रिका उत्तेजना की अनुपस्थिति में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के आधारभूत आंशिक संकुचन है. इसके अलावा, ईसीएम अंग दीवारों और जैव रासायनिक संकेतों के लिए एक जलाशय के रूप में कार्यों के लिए संरचनात्मक समर्थन प्रदान करता है. ये जैव रासायनिक संकेत विभिन्न अंग कार्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं, जैसे विकास को भड़काने और homeostasis को बनाए रखने के रूप में. प्रत्येक अंग के ECM मुख्य रूप से कोलेजन फाइबर से बना है (ज्यादातर कोलेजन प्रकार मैं, III, और वी), लोचदार फाइबर, और ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन / ईसीएम की संरचना और संगठन प्रत्येक अंग के यांत्रिक गुणों को निर्धारित करता है। ईसीएम संरचना में परिवर्तन से प्रजनन रोगों के विकास का कारण बन सकता है, जैसे श्रोणि अंग पतन या समय से पहले गर्भाशय ग्रीवा remodeling। इसके अलावा, ईसीएम माइक्रोस्ट्रक्चर और कठोरता में परिवर्तन चिकनी मांसपेशी सेल गतिविधि और फीनोटाइप को बदल सकता है, जिसके परिणामस्वरूप संकुचन बल की हानि होती है।
इस काम में, रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग एस्ट्रस में 4-6 महीने की उम्र में nonpregnant murine योनि और गर्भाशय ग्रीवा के बेसल टोन और निष्क्रिय यांत्रिक गुणों का आकलन करने के लिए किया जाता है। अंगों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दबाव मायोग्राफ में रखा गया था और दोनों दबाव व्यास और बल लंबाई परीक्षण किया गया. प्रजनन अंगों की यांत्रिक विशेषता के लिए नमूना डेटा और डेटा विश्लेषण तकनीकों को शामिल किया गया है। इस तरह की जानकारी गणितीय मॉडल के निर्माण और तर्कसंगत महिलाओं के स्वास्थ्य रोगों के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप डिजाइन करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
Introduction
योनि दीवार चार परतों से बना है, उपकला, लेमिना प्रोपरिया, मांसपेशियों, और adventitia. उपकला मुख्य रूप से उपकला कोशिकाओं से बना है। लेमिना प्रोपरिया में लोचदार और फाइब्रिलर कोलेजन फाइबर की एक बड़ी मात्रा होती है। मांसपेशियों को भी elastin और कोलेजन फाइबर से बना है, लेकिन चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की एक वृद्धि हुई राशि है. adventitia elastin, कोलेजन, और फाइब्रोब्लास्ट्स के शामिल है, हालांकि पिछले परतों की तुलना में कम सांद्रता में. चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं biomechanically प्रेरित अनुसंधान समूहों के लिए ब्याज के रूप में वे अंगों के संकुचन प्रकृति में एक भूमिका निभा तेहैं. इस तरह के रूप में, चिकनी मांसपेशी सेल क्षेत्र अंश और संगठन परिमाणीकरण यांत्रिक समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. पिछले जांच का सुझाव है कि योनि दीवार के भीतर चिकनी मांसपेशियों की सामग्री मुख्य रूप से परिधीय और अनुदैर्घ्य अक्ष में आयोजित किया जाता है. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पता चलता है कि चिकनी मांसपेशी क्षेत्र अंश दीवार1के समीपस्थ और दूरस्थ दोनों वर्गों के लिए लगभग 35% है .
गर्भाशय ग्रीवा एक उच्च कोलेजन संरचना है, कि हाल ही में जब तक, कम से कम चिकनी मांसपेशियों की कोशिका सामग्री2,3है सोचा था. तथापि, हाल के अध्ययनों से यह पता चला है किचिकनी पेशियों की कोशिकाओं में गर्भाशय 4,5में अधिक बहुतायत और भूमिका हो सकती है . गर्भाशय ग्रीवा चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं की एक ढाल दर्शाती है. आंतरिक ओएस 50-60% चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं जहां बाहरी ओएस केवल 10% शामिल होते हैं. माउस अध्ययन, तथापि, cervix रिपोर्ट 10-15% चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और 85-90% रेशेदार संयोजी ऊतक क्षेत्रीय मतभेदों का कोई उल्लेख के साथ से बना हो6,7,8. यह देखते हुए कि माउस मॉडल अक्सर रिपोर्ट मानव मॉडल से अलग है, माउस गर्भाशय ग्रीवा के विषय में आगे की जांच की जरूरत है.
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य murine योनि और गर्भाशय ग्रीवा के यांत्रिक गुणों को स्पष्ट करने के लिए किया गया था. यह एक दबाव मायोग्राफ डिवाइस है कि परिधीय और अक्षीय दिशाओं में एक साथ यांत्रिक गुणों के आकलन में सक्षम बनाता है, जबकि देशी सेल मैट्रिक्स बातचीत और अंग ज्यामिति को बनाए रखने का उपयोग करके पूरा किया गया था. अंगों दो कस्टम cannulas पर रखा गया था और रेशम 6-0 टांके के साथ सुरक्षित. अनुपालन तथा स्पर्शज्या मोडुली9का निर्धारण करने के लिए अनुमानित शारीरिक अक्षीय खंड के चारों ओर दाब-व्यास परीक्षण किए गए। अनुमानित अक्षीय खंड की पुष्टि करने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि यांत्रिक गुणों को शारीरिक श्रेणी में मात्रा निर्धारित किया गया था, बल-लंबाई परीक्षण किए गए थे। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल estrus में उम्र के 4-6 महीने में nonpregnant murine योनि और गर्भाशय ग्रीवा पर किया गया था.
प्रोटोकॉल दो मुख्य यांत्रिक परीक्षण वर्गों में विभाजित है: बेसल टोन और निष्क्रिय परीक्षण. एक बेसल टोन चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के आधारभूत आंशिक संकुचन के रूप में परिभाषित किया गया है, यहां तक कि बाहरी स्थानीय, हार्मोनल, और तंत्रिका उत्तेजना की अनुपस्थिति में10. योनि और गर्भाशय ग्रीवा के इस आधारभूत संकुचन प्रकृति विशेषता यांत्रिक व्यवहार जो तो दबाव मायोग्राफ प्रणाली द्वारा मापा जाता है पैदावार. निष्क्रिय गुण intercellular कैल्शियम है कि संकुचन की आधारभूत स्थिति का कहना है हटाने के द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की छूट में जिसके परिणामस्वरूप. निष्क्रिय राज्य में, कोलेजन और elastin फाइबर अंगों की यांत्रिक विशेषताओं के लिए प्रमुख योगदान प्रदान करते हैं.
murine मॉडल बड़े पैमाने पर महिलाओं के प्रजनन स्वास्थ्य में रोगों का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। माउस प्रजनन प्रणाली 11,12,13,14के भीतर ईसीएम और यांत्रिक गुणों के बीच विकसित संबंधों की मात्रा निर्धारित करने के लिए कई फायदे प्रदान करता है . इन लाभों में छोटे और अच्छी तरह से विशेषता estrous चक्र, अपेक्षाकृत कम लागत, हैंडलिंग में आसानी, और एक अपेक्षाकृत कम गर्भावधि समय15शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, प्रयोगशाला चूहों के जीनोम अच्छी तरह से मैप किया गया है और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों मशीनी hypotheses16,17,18का परीक्षण करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं।
वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध दाब मायोग्राफ प्रणालियों का उपयोग विभिन्न ऊतकों और अंगों की यांत्रिक प्रतिक्रियाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए बड़े पैमाने पर किया जाता है। दाब मायोग्राफ प्रणाली पर विश्लेषण की गई कुछ उल्लेखनीय संरचनाओं में लोचदार धमनियों में19,20,21,22, नसें और ऊतक इंजीनियर संवहनी कलम23,24, घेघा25, और बड़ी आंतों26. दबाव मायोग्राफ प्रौद्योगिकी अक्षीय और परिधीय दिशाओं में गुणों का एक साथ मूल्यांकन परमिट जबकि देशी सेल-ECM बातचीत को बनाए रखने और विवो ज्यामिति में. नरम ऊतक और अंग यांत्रिकी में मायोग्राफ सिस्टम के व्यापक उपयोग के बावजूद, दबाव मायोग्राफ प्रौद्योगिकी का उपयोग करने वाला एक प्रोटोकॉल पहले योनि और गर्भाशय ग्रीवा के लिए विकसित नहीं किया गया था। योनि और ग्रीवा के यांत्रिक गुणों की पूर्व जांच कामूल्यांकन किया गया. तथापि, ये अंग शरीरकेभीतर 29,30के भीतर बहुअक्षीय लदान का अनुभव करते हैं, इस प्रकार उनकी द्विअक्षीय यांत्रिक प्रतिक्रिया की मात्रा निर्धारित करना महत्वपूर्ण है।
इसके अलावा , हाल के काम से पता चलता है चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं नरम ऊतक रोगों में एक संभावित भूमिका निभा सकते हैं5,28,31,32. यह दबाव मायोग्राफ प्रौद्योगिकी का उपयोग करने का एक और आकर्षण प्रदान करता है, क्योंकि यह देशी सेल-मैट्रिक्स बातचीत को बरकरार रखता है, इस प्रकार योगदान की वर्णन की अनुमति देता है कि चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को शारीरिक और pathophysiological में खेलते हैं शर्तों. इसमें, हम योनि के बहुअक्षीय यांत्रिक गुणों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं और बेसल टोन और निष्क्रिय परिस्थितियों दोनों के तहत गर्भाशय ग्रीवा हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में प्रदान प्रोटोकॉल murine योनि और गर्भाशय ग्रीवा के यांत्रिक गुणों का निर्धारण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है. इस प्रोटोकॉल में विश्लेषण यांत्रिक गुणों दोनों अंगों के निष्क्रिय और बेसल टोन …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को एनएसएफ केरियर पुरस्कार अनुदान #1751050 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 2F catheter | Millar | SPR-320 | catheter to measure cervical pressure |
| 6-0 Suture | Fine Science Tools | 18020-60 | larger suture ties |
| CaCl2 (anhydrous) | VWR | 97062-590 | HBSS concentration: 140 mg/ mL |
| CaCl2-2H20 | Fischer chemical | BDH9224-1KG | KRB concentration: 3.68 g/L |
| Dextrose (D-glucose) | VWR | 101172-434 | HBSS concentration: 1000 mg/mL KRB concentration: 19.8 g/L |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | curved forceps |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | straight forceps |
| Eclipse | Nikon | E200 | microscope used for imaging |
| Flow meter | Danish MyoTechnologies | 161FM | flow meter within the testing apparatus |
| Force Transducer – 110P | Danish MyoTechnologies | 100079 | force transducer |
| ImageJ | SciJava | ImageJ1 | used to measure volume |
| Instrument Cases | Fine Science Tools | 20830-00 | casing to hold dissection tools |
| KCl | Fisher Chemical | 97061-566 | HBSS concentration: 400 mg/ mL KRB concentration: 3.5 g/L |
| KH2PO4 | G-Biosciences | 71003-454 | HBSS concentration: 60 mg/ mL |
| MgCl2 | VWR | 97064-150 | KRB concentration: 1.14 g/L |
| MgCl2-6H2O | VWR | BDH9244-500G | HBSS concentration: 100 mg/ mL |
| MgSO4-7H20 | VWR | 97062-134 | HBSS concentration: 48 mg/ mL |
| Mircosoft excel | Microsoft | 6278402 | program used for spreadsheet |
| Na2HPO4 (dibasic anhydrous) | VWR | 97061-588 | HBSS concentration: 48 mg/mL KRB concentration: 1.44 g/L |
| NaCl | VWR | 97061-274 | HBSS concentration: 8000 mg/mL KRB concentration: 70.1 g/L |
| NaHCO3 | VWR | 97062-460 | HBSS concentration: 350 mg/ mL KRB concentration: 21.0 g/L |
| Pressure myograph systems | Danish MyoTechnologies | 110P and 120CP | Pressure myograph system: prorgram, cannulation device, and controller unit |
| Pressure Transducer | Danish MyoTechnologies | 100106 | pressure transducer |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | straight forceps |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | micro-scissors |
| Tissue dye | Bradley Products | 1101-3 | ink to measure in vivo stretch |
| Ultrasound transducer | FujiFilm Visual Sonics | LZ-550 | ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency |
| VEVO2100 | FujiFilm Visual Sonics | VS-20035 | ultrasound used for imaging |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | larger scissors |
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