자동 및 프로테아소말 플럭스에서 일주 리듬 측정
Summary
우리는 autophagy및 마우스 간에서 proteasome를 통해 단백질 이화 작용에 있는 생물학 리듬을 측정하기 위한 우리의 프로토콜을 기술합니다.
Abstract
세포는 리소좀 및 비 리소좀 경로를 포함하여 원치 않는 단백질 및 기타 물질을 재활용하는 여러 가지 방법을 사용합니다. 주요 리소좀 의존적 통로는 autophagy에게 불리고, 단백질 이화작용에 대한 1 차적인 비 리소좀 방법은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템입니다. 모형 유기체에 있는 최근 연구 결과는 autophagy와 유비퀴틴 proteasome 시스템의 활동이 하루 에 걸쳐 일정하지 않다는 것을 건의합니다 그러나 대신 매일 (circadian) 리듬에 따라 변화합니다. 단백질 회전율에 있는 생물학 리듬을 측정하는 기능은 세포 질 통제가 어떻게 달성되는지 이해하고 관심 있는 특정 단백질의 역학을 이해하기 를 위해 중요합니다. 여기에서 우리는 단백질 회전율의 circadian 분대를 붙잡는 생체 내 자동 파기 및 proteasomal 플럭스를 정량화하기 위한 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 당사의 프로토콜에는 마우스 처리, 조직 처리, 분획 및 마우스 간을 원료로 사용하는 자가 유속 정량화에 대한 세부 정보가 포함됩니다.
Introduction
Circadian 리듬은 자연 전체에 걸쳐 명백한 생물학적 기능에 있는 매일, 예측 가능한 변이를 참조합니다. 그(것)들은 모든 생물학 규모에서, 잠 각성 주기 같이 거시적인 행동에서, 생체 분자의 리듬 풍부 같이 분자 현상에, 존재합니다. 최근 몇 년 동안, circadian 리듬에 대 한 연구는 circadian 리듬 생성에 대 한 중요 한 “시계 유전자”의 발견에 의해 변환 되었습니다. 시계 유전자 녹아웃 마우스에 있는 연구 결과는 물질 대사와 같은 핵심 세포 프로세스를 시간적으로 조직하는 circadian 리듬을 위한 중앙 역할을 밝혔습니다1. circadian 리듬이 이것을 일어나는 방법 중 단백질 이화작용에 시간구조를 부여하여입니다.
당사를 포함한 여러 그룹은 세포 단백질 이화작용, 자가포식 및 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 위한 두 가지 주요 경로가 일주 리듬2,3,4,5의영향을 받는다는 것을 보여주었습니다. Autophagy는 관심있는 단백질이 열화 세포기관에 전달되는 단백질 이화 작용의 리소좀 의존팔을 나타내며, 이는 새로운 소포(macroautophagy)의 시공을 통해 또는 직접적인 전좌를 통해 전달됩니다. 채널 (샤페론 중재 autophagy)6. 유비퀴틴-프로테아좀 시스템은 단백질이 폴리-유비퀴틴화되고 프로테아솜으로 공급되는 주요 비리소솜 통로이며, 세포질과 핵7,8에서발견되는 거대 분자 분해 기계이다. 자동 및 프로테아소말 활동의 리듬은 세포 하우스키핑에 중요한 역할을 할 가능성이 있기 때문입니다. 그 결과, 전임상 질환 모델과 호환되는 단백질 이화작용의 일일 진동을 감지할 수 있는 표준화된 절차를 하는 것이 중요합니다.
여기에서, 우리는 우리의 실험실3,9에서일의 기초로 봉사한 마우스 간에서 autophagic 유속에 있는 일변을 정량화하기 위한 우리의 프로토콜을 제공합니다. 우리의 방법은 “회전율 분석”10,프로테오리틱 활성(또는 플럭스)을 측정하기 위해 수많은 그룹에서 사용하는 접근법으로 분류된다. 이러한 접근법에서, 리소좀 또는 프로테아좀에 특이적인 프로테아제 억제제는 마우스에 투여되고 그 후 조직 샘플은 고정된 시간 간격 후에 수득된다. 병렬로, 조직 샘플은 가짜 주사를 행한 마우스로부터 수득된다. 조직 샘플은 균질화한 다음 생화학적으로 분리되어 리소좀이 농축되고 세포질 분획을 수득합니다. 이 분획은 그 때 macroautophagy 마커 (LC3b 및 p62) 또는 proteasomal 기질 (poly-ubiquitated 단백질)에 특이적인 항체를 사용하여 서쪽 blotting를 통해 병렬로 분석됩니다. 시간이 지남에 따라 프로테아제 억제제가 주입된 동물은 일반적으로 재활용되었을 단백질을 축적합니다. 그 결과, 프로테아제 억제제 처리 된 샘플에서 마커 단백질의 풍부를 샴 처리 샘플과 비교하여 회전율의 비율을 추론합니다. 하루 에 걸쳐 고정 된 시간 간격으로이 방법을 반복함으로써 프로테오 리시스(그림 1A)에서circadian 변이를 재구성 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 프로토콜은 일반적으로 이용 가능한 분자 생물학 장비를 사용하여 마우스에 있는 단백질 회전율에 있는 생물학 리듬을 측정하는 기술적으로 간단한 수단을 기술합니다. 시간차등의 실험의 길이와 관련된 생물학적 샘플의 수로 인해 마우스가 주입되는 방법, 조직 획득 시기 및 생화학 적 처리에 관한 전체 실험에서 일관성을 두는 것이 중요합니다. 샘플. 주사, 안락사 및 자궁 경부 탈구 단…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 RO1HL135846과 어린이 개발 연구소 보조금 (PD-II-2016-529)에 의해 지원되었다.
Materials
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping Circadian Rhythms in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
