Misurazione dei ritmi diurni nel flusso autofagico e proteasomico
Summary
Descriviamo il nostro protocollo per la misurazione dei ritmi biologici nel catabolismo proteico tramite l’autofagia e il proteasome nel fegato di topo.
Abstract
Le cellule impiegano diversi metodi per riciclare proteine indesiderate e altro materiale, tra cui vie lisosomiali e non lisosomiche. Il principale percorso dipendente dal lisosoma è chiamato autofagia, mentre il metodo primario non lisosomico per il catabolismo proteico è il sistema ubiquitina-proteasome. Recenti studi su organismi modello suggeriscono che l’attività sia dell’autofagia che del sistema ubiquitina-proteasoma non è costante per tutto il giorno, ma varia invece in base a un ritmo quotidiano (circadiano). La capacità di misurare i ritmi biologici nel turnover delle proteine è importante per comprendere come si ottiene il controllo della qualità cellulare e per comprendere le dinamiche di specifiche proteine di interesse. Qui presentiamo un protocollo standardizzato per quantificare il flusso autofagico e proteasomico in vivo che cattura la componente circadiana del turnover delle proteine. Il nostro protocollo include dettagli per la movimentazione del mouse, l’elaborazione dei tessuti, la frazione e la quantificazione del flusso autofagico utilizzando il fegato di topo come materiale di partenza.
Introduction
I ritmi circadiani si riferiscono a variazioni giornaliere prevedibili nella funzione biologica che sono evidenti in tutta la natura. Esistono ad ogni scala biologica, da comportamenti macroscopici come i cicli sonno-veglia, a fenomeni molecolari come l’abbondanza ritmica di biomolecole. Negli ultimi anni, la ricerca sui ritmi circadiani è stata trasformata dalla scoperta di “geni dell’orologio” che sono critici per la generazione di ritmi circadiani. Studi sui topi knockout genici dell’orologio hanno rivelato un ruolo centrale per i ritmi circadiani nell’organizzare temporaneamente i processi cellulari di base come il metabolismo1. Tra i modi in cui i ritmi circadiani fanno questo accadere è impartire una struttura temporale al catabolismo proteico.
Diversi gruppi tra cui il nostro hanno dimostrato che le due principali vie per il catabolismo cellulare proteico, l’autofagia e il sistema ubiquitina-proteasoma, sono soggette a ritmi diurni2,3,4,5. L’autofagia rappresenta il braccio lisoso-dipendente del catabolismo proteico in cui le proteine di interesse vengono consegnate a questo organello degradante sia attraverso la costruzione di un nuovo vescicolo (macroautofagia) sia attraverso la traslocazione diretta canale (chaperone mediato autofagia)6. Il sistema ubiquitina-protasosoma è la principale via non lisomica, dove le proteine sono poli-ubiquitinate e poi alimentate nel proteasome, una macchina degradativa macromolecolare trovata in tutto il citoplasma e nucleo7,8. I ritmi nell’attività autofagica e proteasomica sono importanti perché probabilmente svolgono un ruolo nella pulizia cellulare. Di conseguenza, è importante avere una procedura standardizzata in grado di rilevare le oscillazioni giornaliere nel catabolismo proteico che è compatibile con i modelli di malattia pre-clinica.
Qui, forniamo il nostro protocollo per quantificare le variazioni diurne nel flusso autofagico nel fegato di topo, che è servito come base per il lavoro nel nostro laboratorio3,9. Il nostro metodo è classificato come un “asay di turnover”10, un approccio utilizzato da numerosi gruppi per misurare l’attività proteolitica (o flusso). In questo approccio, gli inibitori della proteasi specifici dei lisosomi o proteasomi vengono somministrati ai topi e quindi i campioni di tessuto vengono ottenuti dopo un intervallo di tempo fisso. Parallelamente, i campioni di tessuto sono ottenuti da topi sottoposti a iniezioni fittizie. I campioni di tessuto vengono omogeneizzati e poi separati biochimicamente per ottenere le frazioni arricchite e citoplasmase arricchite dal lisosomia. Queste frazioni vengono quindi analizzate in parallelo tramite gonfiore occidentale utilizzando anticorpi specifici per marcatori macroautofagia (LC3b e p62) o substrati proteasomici (proteina poli-ubiquitinated). Nel corso del tempo, gli animali iniettati con inibitori della proteasi accumulano proteine che normalmente sarebbero state riciclate. Di conseguenza, il tasso di rotazione viene dedotto confrontando l’abbondanza di proteine marcatore nei campioni trattati con proteasi-inibizionista con i campioni trattati con finta. Ripetendo questo metodo a intervalli di tempo fissi nel giorno è possibile ricostruire le variazioni circadiane nella proteolisi (Figura 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro protocollo descrive un mezzo tecnicamente semplice per misurare i ritmi biologici nel turnover delle proteine nei topi utilizzando attrezzature di biologia molecolare comunemente disponibili. A causa della durata degli esperimenti di serie temporali e del numero di campioni biologici coinvolti, è importante essere coerenti nell’intero esperimento per quanto riguarda l’iniettazione dei topi, i tempi di acquisizione dei tessuti e l’elaborazione biochimica di Campioni. Le fasi di iniezione, eutanasia e dislocazio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da RO1HL135846 e da una sovvenzione dell’Istituto per lo sviluppo dei bambini (PD-II-2016-529).
Materials
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
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