Het meten van de diurnale ritmes in autophagic en Proteasomale flux
Summary
We beschrijven ons protocol voor het meten van biologische ritmes in eiwit katabolisme via autophagy en het proteasoom in muis lever.
Abstract
Cellen maken gebruik van verschillende methoden voor het recyclen van ongewenste eiwitten en ander materiaal, waaronder lysosomale en niet-lysosomale trajecten. Het belangrijkste lysosome-afhankelijke traject wordt autophagie genoemd, terwijl de primaire niet-lysosomale methode voor eiwit katabolisme het ubiquitin-proteasome systeem is. Recente studies in model organismen suggereren dat de activiteit van zowel autophagie als het ubiquitin-proteasome systeem niet constant is gedurende de dag, maar in plaats daarvan varieert volgens een dagelijks (circadiane) ritme. Het vermogen om biologische ritmes in eiwit omzet te meten is belangrijk om te begrijpen hoe cellulaire kwaliteitscontrole wordt bereikt en om de dynamiek van specifieke eiwitten van belang te begrijpen. Hier presenteren we een gestandaardiseerd protocol voor het kwantificeren van autophagische en proteasomale flux in vivo die de circadiane component van eiwit omzet vangt. Ons protocol bevat Details voor muis afhandeling, weefsel verwerking, fractionering en autophagische flux kwantificering met behulp van de muis lever als uitgangsmateriaal.
Introduction
Circadiane ritmes verwijzen naar dagelijkse, voorspelbare variaties in biologische functie die zichtbaar zijn in de hele natuur. Ze bestaan op elke biologische schaal, van macroscopisch gedrag zoals slaap-waak cycli, tot moleculaire fenomenen zoals de ritmische overvloed van biomoleules. In de afgelopen jaren is het onderzoek naar circadiane ritmes getransformeerd door de ontdekking van “klok genen” die van cruciaal belang zijn voor de circadiane ritme generatie. Studies in de klok Gene knock-out muizen hebben een centrale rol voor circadiane ritmes onthuld in het tijdelijk organiseren van kern cellulaire processen zoals metabolisme1. Onder de manieren die circadiane ritmes maken dit gebeurt door het doorvoeren van een temporele structuur aan eiwit katabolisme.
Verschillende groepen, waaronder de onze, hebben aangetoond dat de twee belangrijkste wegen voor cellulaire eiwit katabolisme, autophagie en het ubiquitin-proteasome-systeem, onderhevig zijn aan de diurnale ritmes2,3,4,5. Autophagy vertegenwoordigt de lysosome-afhankelijke arm van eiwit katabolisme waarbij eiwitten van belang worden geleverd aan deze degradatieve organel hetzij door de bouw van een roman blaasje (macroautophagy) of via directe translocatie hoewel een kanaal (Chaperone gemedieerde autophagy)6. Het ubiquitin-proteasome-systeem is het belangrijkste niet-lysosomale traject, waar eiwitten poly-alomtegenwoordig zijn en vervolgens in het proteasoom worden gevoerd, een macromoleculaire degradatieve machine die wordt gevonden in het cytoplasma en Nucleus7,8. Ritmes in autophagic en proteasomale activiteit zijn belangrijk omdat ze waarschijnlijk een rol spelen in de cellulaire huishouding. Als gevolg hiervan is het waardevol om een gestandaardiseerde procedure te hebben die dagelijkse oscillaties in eiwit katabolisme kan detecteren die compatibel is met preklinische ziekte modellen.
Hier bieden we ons protocol voor het kwantificeren van de diurnale variaties in autophagic flux in muis lever, die als basis voor het werk in ons laboratorium3,9heeft gediend. Onze methode is geclassificeerd als een “omzet assay”10, een benadering die door tal van groepen wordt gebruikt om Proteolytische activiteit (of flux) te meten. In deze benadering worden proteaseremmers die specifiek zijn voor lysosomen of Proteasomen toegediend aan muizen en vervolgens worden weefselmonsters verkregen na een vast tijdsinterval. Parallel, weefselmonsters worden verkregen van muizen onderworpen aan schijn injecties. De weefselmonsters worden gehomogeniseerd en vervolgens biochemisch gescheiden om de lysosome-verrijkt en cytoplasmische fracties te verkrijgen. Deze fracties worden vervolgens parallel geanalyseerd via Western blotting met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor macroautophagy markers (LC3b en P62) of proteasomale substraten (poly-alomtegenwoordige eiwitten). Na verloop van tijd verzamelen dieren die met proteaseremmers zijn geïnjecteerd eiwitten die normaalgesproken zijn gerecycled. Dientengevolge wordt het percentage van de omzet afgeleid door de overvloed aan marker proteïnen in de behandelde monsters van de protease-remmer te vergelijken met de met placebo behandelde monsters. Door deze methode op vaste tijdstippen gedurende de dag te herhalen, is het mogelijk om circadiane variaties in proteolyse te reconstrueren (Figuur 1a).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ons protocol beschrijft een technisch eenvoudig middel voor het meten van biologische ritmes in eiwit omzet bij muizen die gebruikmaken van algemeen verkrijgbare moleculaire biologie apparatuur. Vanwege de duur van de tijdreeksen experimenten en het aantal betrokken biologische monsters, is het belangrijk om consistent te zijn over het hele experiment met betrekking tot hoe de muizen worden geïnjecteerd, de timing van weefsel verwerving en de biochemische verwerking van Monsters. De injectie, euthanasie en cervicale dis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door RO1HL135846 en een Children’s Development Institute subsidie (PD-II-2016-529).
Materials
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping Circadian Rhythms in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
