מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף
Summary
אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו למדידת מקצבים ביולוגיים בקטוליזם חלבונים באמצעות הוראות משוב ושוב בכבד העכבר.
Abstract
תאים מעסיקים מספר שיטות למיחזור חלבונים בלתי רצויים וחומרים אחרים, כולל ליזוזומיום ושבילים לא-ליסוזומ. המסלול העיקרי התלוי למטה מכונה באופן אוטומטי, ואילו השיטה העיקרית שאינה ליסוזומלית עבור קטאבוליזם חלבונים היא מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין. מחקרים שנעשו לאחרונה במודל אורגניזמים מצביעים על כך שהפעילות של שני הדגמים האוטומטיים ומערכת אוביקוויב-פרוטאסאין אינה קבועה לאורך היום, אך במקום זאת משתנה בהתאם לקצב היומי (circadian). היכולת למדוד מקצבים ביולוגיים במחזור החלבונים חשוב להבין כיצד מושגת בקרת איכות סלולרית ולהבנת הדינמיקה של חלבונים ספציפיים המעניינים אותך. כאן אנו מציגים פרוטוקול מתוקננת עבור ככמת השטף האוטומטי ו הפרוטאסאואל בvivo כי לוכדת את רכיב האחראי של מחזור החלבון. הפרוטוקול שלנו כולל פרטים על הטיפול בעכבר, רקמת עיבוד, משבר, וכימות השטף האוטומטית באמצעות הכבד של העכבר כמו החומר ההתחלתי.
Introduction
מקצבים circadian מתייחסים היום, וריאציות צפויות בתפקוד הביולוגי הגלויים ברחבי הטבע. הם קיימים בכל קנה מידה ביולוגי, מהתנהגויות מאקרוסקופיות כמו מחזורי התעוררות לשינה, לתופעות מולקולריות כמו השפע הקצבי של biomolecules. בשנים האחרונות, המחקר לתוך מקצבים מעגליות השתנה על ידי גילוי של “גנים שעון” כי הם קריטיים ליצירת קצב מעגלי. מחקרים בשעון גנים הסתרה עכברים חשפו תפקיד מרכזי עבור מקצבים מעגליות באופן זמני ארגון תהליכים סלולאריים ליבה כגון חילוף החומרים1. בין הדרכים מקצבים מעגליות לגרום לזה לקרות הוא על ידי הקניית מבנה זמני לקטוליזם חלבון.
מספר קבוצות כולל שלנו הראו כי שתי השדרות הגדולות לקטאבליזם חלבונים סלולריים, התצוגה האוטומטית של מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין, הם כפופים מקצבים יומי2,3,4,5. הבחירה האוטומטית מייצגת את הזרוע התלוית-ליקיה של קטאבוליזם חלבונים, שבה חלבונים מעניינים מועברים לdegradative זה או דרך הבנייה של שלפוחית הרומן (מאקרואוטומטית) או באמצעות טרנסלוקציה ישירה למרות ש ערוץ (שלווה אוטומטית מתווכת)6. מערכת אוביקוויב-פרוטסאין היא מסלול הראשי ללא-ליזוזומלית, שם חלבונים הם פולי-אוביקוויל ולאחר מכן ניזונים לתוך פרוטאסדום, מכונת macromolecular degradative שנמצאו ברחבי הציטופלסמה וגרעין7,8. המקצבים בפעילות האוטומטית והפרוטאספראל הם חשובים מכיוון שהם נוטים לשחק תפקיד במשק הבית הסלולרי. כתוצאה מכך, זה חשוב שיש הליך מתוקננת שיכול לזהות תנודות יומיות של קטאבוליזם חלבונים התואמים עם מודלים טרום קליניים מחלות.
כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול שלנו כדי לכמת וריאציות יומי השטף האוטומטי בכבד העכבר, אשר שימש כבסיס לעבודה במעבדה שלנו3,9. השיטה שלנו מסווגת “שיטת מחזור”10, גישה המשמשת על ידי קבוצות רבות כדי למדוד פעילות פרוטחרדה (או שטף). בגישה זו, מעכבי פרוטאז ספציפיים לlysosomes או פרוטאסמס ניתנת לעכברים ולאחר מכן דגימות רקמות מתקבלים לאחר מרווח זמן קבוע. במקביל, דגימות רקמות מתקבלות מעכברים נתון זריקות מזויף. דגימות רקמות הם הומוגניים ולאחר מכן ביולוגי הופרדו כדי לקבל את השברים lysosome מועשר, cytoplasmic. שברים אלה מנותח לאחר מכן במקביל דרך הכתמים המערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים סמנים macroLC3b hagy (ו-p62) או מצעים פרוטאספאל (חלבון פולי-אוביקטים). במשך הזמן, חיות מוזרק עם מעכבי פרוטאז לצבור חלבונים שהיו בדרך כלל היה ממוחזר. כתוצאה מכך, שיעור המחזור משתמעת על ידי השוואת השפע של חלבונים סמן בדגימות פרוטאז-מעכב הטיפול לדגימות מטופל המזויף. על-ידי חזרה על שיטה זו במרווחי זמן קבועים לאורך היום, ניתן לשחזר וריאציות מעגליות ב-פרוטפוליזיס (איור 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שלנו מתאר אמצעי מבחינה טכנית פשוטה למדידת מקצבים ביולוגיים במחזור החלבונים בעכברים באמצעות ציוד מולקולרי זמין נפוץ בביולוגיה. בגלל המשך הניסויים בסדרת הזמן ומספר הדגימות הביולוגי המעורבות, חשוב להיות עקבי לאורך כל הניסוי בנוגע לאופן הזרקת העכברים, התזמון של רכישת רקמות והעיב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי RO1HL135846 ומענק מכון לפיתוח ילדים (PD-II-2016-529).
Materials
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping Circadian Rhythms in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
