测量自噬和前列腺通量中的日节律
Summary
我们描述了我们通过自噬和小鼠肝脏蛋白体体来测量蛋白质代谢的生物节律的规程。
Abstract
细胞采用多种方法来回收不需要的蛋白质和其他材料，包括脂质体和非脂质体通路。主要的脂质体依赖途径称为自噬，而蛋白质代谢的主要非脂质酶体方法是泛基蛋白-蛋白酶体系统。最近对模型生物体的研究表明，自噬和泛性蛋白酶体的活性在一天中不是恒定的，而是根据每日（循环）节律而变化的。测量蛋白质周转中生物节律的能力对于了解细胞质量控制是如何实现的以及了解特定感兴趣的蛋白质的动态非常重要。在这里，我们提出了一个标准化的协议，用于量化体内的自噬和蛋白酶体通量，捕获蛋白质周转的昼夜分量。我们的协议包括小鼠处理、组织处理、分馏和以小鼠肝脏为起始材料的自噬性通量定量的详细信息。
Introduction
昼夜节律是指生物功能中每天可预测的变化，这种变化在自然界中是明显的。它们存在于各种生物尺度上，从睡眠-觉醒周期等宏观行为，到生物分子的有节奏丰度等分子现象。近年来，对昼夜节律的研究已经因”时钟基因”的发现而改变，这些”时钟基因”对昼夜节律生成至关重要。对时钟基因敲除小鼠的研究表明，昼夜节律在时间组织核心细胞过程（如代谢1）中起着核心作用。昼夜节律使这一点发生的方式之一是赋予蛋白质代谢一个时间结构。
包括我们的几个组已经表明，细胞蛋白代谢、自噬和泛性蛋白-蛋白酶系统的两个主要途径，受日节律2，3，4，5。自噬代表蛋白质代谢的感其中体依赖性手臂，其中感兴趣的蛋白质通过构建新型囊泡（大自噬）或通过直接易位通过通道（卡佩罗内介自噬）6.泛性蛋白-蛋白酶体系统是主要的非脂生通路，其中蛋白质是多聚体，然后送入蛋白酶体，这是在整个细胞质和细胞核7、8中发现的大分子降解机。自噬和蛋白酶活动的节奏很重要，因为它们可能在细胞内务管理中发挥作用。因此，有一个标准化的程序，可以检测与临床前疾病模型兼容的蛋白质代谢的每日振荡是有价值的。
在这里，我们提供我们的协议，以量化小鼠肝脏中自噬性通量的日变化，这已成为我们实验室3、9工作的基础。我们的方法被归类为”周转测定”10，这是许多组用来测量蛋白解酶活性（或通量）的方法。在这种方法中，对小鼠施用特定于其体或蛋白酶体的蛋白酶抑制剂，然后在固定的时间间隔后获得组织样本。同时，组织样本从接受假注射的小鼠身上获得。组织样本均质化，然后进行生化分离，以获得体素富集和细胞质分。然后，使用特定于大自噬标记物（LC3b 和 p62）或蛋白酶基质（多聚体蛋白）的抗体，通过西方印迹对这些馏分进行并行分析。随着时间的推移，注射蛋白酶抑制剂的动物会积累通常被回收的蛋白质。因此，通过比较蛋白酶抑制剂处理样品中的标记蛋白的丰度与假处理的样品，可以推断出周转率。通过在一天的固定时间间隔重复此方法，可以重建蛋白解中的昼夜变化（图1A）。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们的协议描述了一种技术上简单的方法，使用常用的分子生物学设备测量小鼠蛋白质周转中的生物节律。由于时间序列实验的长度和所涉及的生物样本数量，因此在整个实验中，在小鼠的注射方式、组织采集的时间和生化处理方面保持一致非常重要。样品。注射、安乐死和宫颈脱位步骤可能需要操作员在开始全面实验之前进行练习。由于不同的个体以不同的速度解剖，因此最好由单个操作员进?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由RO1HL135846和儿童发展研究所赠款（PD-II-2016-529）资助。
Materials
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping Circadian Rhythms in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
