UV-Vis및 말라리아 방지 프리마퀸의 육안 측정을 위한 최적화된 Griess 반응
Summary
이 프로토콜은 합성 소변 및 인간 혈청에서 말라리아 프리마퀸 (PMQ) 검출을위한 새로운 색채 방법을 설명합니다.
Abstract
Primaquine (PMQ), 중요 한 안티 말라리아 약물, 세계 보건 기구에 의해 권장 되었습니다 (WHO) P. vivax와 ovale에의해 발생 하는 생명을 위협 하는 감염의 치료에 대 한. 그러나, PMQ는 포도당-6-인산 탈수소 효소 (G6PD) 결핍을 가진 환자에 있는 심각한 용혈으로 이끌어 내는 원치 않는 역효과가 있습니다. 복용량 모니터링의 목적으로 PMQ 결정에 대 한 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 개발 하는 필요가 있다. 2019년 초, PMQ 색채 정량화를 위한 UV-Vis 및 육안 기반 접근법을 보고했습니다. 검출은 PMQ와 anilines 사이의 Griess와 같은 반응을 기반으로하여 착색 된 아조 제품을 생성 할 수 있습니다. 합성 소변에서 PMQ의 직접 측정에 대한 검출 한계는 나노 몰 범위에 있다. 더욱이, 이 방법은 임상적으로 관련된 농도에서 인간 혈청 샘플로부터 PMQ 정량화에 대한 큰 잠재력을 보여주었다. 이 프로토콜에서는 유색 아조 제품의 합성 및 특성화, 시약 준비 및 PMQ 결정 절차에 대한 기술적 세부 사항을 설명합니다.
Introduction
PMQ는 가장 중요한 말라리아 약물 중 하나이며, 재발을 방지하기 위해 조직 주혈계뿐만 아니라 질병전염을방해하는 게임 세포질로도 작동1,2,3,4. 혈관 내 용혈은 PMQ의 부작용에 관한 중 하나입니다, 이는 G6PD에 그 결핍에 매우 심각해진다. G6PD 유전 무질서는 말라리아 풍토성 지역에 있는 3-30% 사이 유전자 주파수로 세계전반 분포한다는 것을 알려지다. PMQ 약점의 엄격은 G6PD 부족의 정도 뿐만 아니라 복용량 및 PMQ 노출의 내구에 달려있습니다5,6. 위험을 낮추기 위해 WHO는 말라리아 치료를 위해 PMQ의 단일 저용량(0.25 mg 염기/kg)을 권장했습니다. 그러나, 이것은 여전히 환자 약물 감수성5,7의변화에 의해 도전된다. 용량 모니터링은 PMQ 투여 후 약물 동력학을 평가하는 데 필요하며, 이는 제한된 독성으로 성공적인 치료를 위한 투여 량 조정에 영향을 미칠 수 있다.
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 PMQ 임상 측정에 가장 널리 사용되는 기술입니다. Endoh 등은 C-18 폴리머 겔 컬럼8을사용하여 혈청 PMQ 정량화를 위한 UV 검출기를 이용한 HPLC 시스템을 보고하. 그들의 시스템에서, 혈청 단백질은 먼저 아세토니트릴로 침전되었고, 그 후 상층부에서PMQ를 HPLC용으로 분리시켰다. 교정 곡선은 0.01-1.0 μg/mL8의농도 범위에 걸쳐 선형이었습니다. 254 nm에서 UV 검출을 이용한 역상 HPLC에 기초한 또 다른 방법은 PMQ 및 이의 주요 대사산물9의정량화를 위해 보고되었다. PMQ의 교정 곡선은 0.025-100 μg/mL 사이의 범위에서 선형이었습니다. 유기상으로서 헥산과 에틸 아세테이트를 혼합한 추가의 액체-액체 추출은 89%9에도달한 백분율 회수와 함께 PMQ 분리를 위해 사용되었다. 최근에는 미란다 외가 3 μg/mL10의검출 한계를 가진 정제 제형에서 PMQ 분석을 위해 260 nm에서 UV 검출을 하는 UPLC 방법을 개발했습니다.
HPLC 방법은 약물 측정에 유망한 감도를 나타내고 HPLC가 질량 분석기가 장착되어 있는 경우 감도가 더욱 향상될 수 있지만 여전히 몇 가지 단점이 있습니다. 많은 생체 분자가 분석에 크게 영향을 미칠 수 있기 때문에 생물학적 유체의 직접 약물 측정은 일반적으로 HPLC에 의해 접근 할 수 없습니다. 추가 추출은 HPLC 분석11,12전에 내인성 분자를 제거하는 데 필요합니다. 더욱이, HPLC-UV 검출기에 의한 PMQ 검출은 전형적으로 최대 흡수 파장(260 nm)에서 수행된다. 그러나, 260 nm에서 강한 흡광도를 가진 생물학 액체에 있는 많은 내인성 분자가 있습니다 (예를 들면, 아미노산, 비타민, 핵산 및 비뇨기과 색소), 따라서 PMQ UV 검출을 방해하. 합리적인 감도와 선택성을 갖춘 PMQ 측정을 위한 간단하고 비용 효율적인 방법을 개발할 필요가 있습니다.
Griess 반응은 아질산염검출13,14,15,16에대한 비대검 시험으로서 1879년에 처음 발표되었다. 최근, 이러한 반응은 아질산염뿐만 아니라 다른 생물학적으로 관련된 분자17,18,19,20을검출하기 위해 광범위하게 탐구되고 있다. 우리는 이전에 PMQ를 가진 예기치 않은 Griess 반응의 첫번째 체계적인 연구 결과 보고했습니다(그림 1). 이 시스템에서 PMQ는 산성 조건하에서 아질산 이온이있는 경우 대체 된 음선과 결합 될 때 착색 된 아조스를 형성 할 수 있습니다. 우리는 또한 아조스의 색이음질(21)에대한 대체물의 대체기의 기부 효과를 증가시킬 때 노란색에서 파란색으로 변화한다는 것을 발견했다. PMQ 정량화를 위한 UV-vis 흡수 기반 착색 방법은 4-메톡시아닌산염과 PMQ 사이의 최적화된 반응을 통해 개발되었습니다. 이 방법은 생체 관련 유체에서 PMQ의 민감하고 선택적 검출에 대한 큰 잠재력을 보여주었습니다. 여기서는 이 대색 전략을 기반으로 PMQ 결정에 대한 자세한 절차를 설명하는 것을 목표로 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
편리한 PMQ 정량화를 위한 대색 방법을 설명했습니다. 잠재적으로 가장 간단하고 비용 효율적인 현재 방법입니다. 더 중요한 것은, 이 방법은 어떤 장비를 사용하지 않고 육안 기반 PMQ 측정을 가능하게 제공 제공합니다.
PMQ 검출을 위한 최적화된 Griess 반응은 504 nm에서 최대 흡수를 가진 적색 아조를 생성할 수 있습니다. 내인성 생체 분자의 UV-vis 흡수로 인한 잠재적 영향은 제?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 광저우 중국 의학 대학의 창업 보조금과 GZUCM의 청소년 과학 연구 교육 프로젝트 (2019QNPY06)를 인정합니다. 우리는 또한 시설에 대한 지원에 대한 광저우 중국 의학 대학의 링난 의학 연구 센터를 인정합니다.
Materials
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
References
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