Visualisere og analysere intracellulære transport av organeller og andre cargos i astrocytter

Summary

Her beskriver vi en in vitro Live-imaging metode for å visualisere intracellulære transport av organeller og smugling av plasma membran proteiner i murine astrocytter. Denne protokollen presenterer også en bildeanalyse metodikk for å bestemme laste transport ruter og Kinetics.

Abstract

Astrocytter er blant de mest tallrike celletyper i den voksne hjernen, hvor de spiller nøkkelroller i et mangfold av funksjoner. Som en sentral aktør i hjernen homeostase, astrocytter forsyne neurons med vitale metabolitter og buffer ekstracellulære vann, ioner og glutamat. En integrert del av “Tri-partite” synapse, astrocytter er også avgjørende i dannelsen, beskjæring, vedlikehold, og modulering av synapser. For å aktivere disse svært interaktive funksjoner, astrocytter kommunisere seg imellom og med andre gliacellene celler, neurons, hjernen blodkar, og ekstracellulære miljø gjennom en rekke spesialiserte membran proteiner som inkluderer celle vedheft molekyler, akvaporiner, ion kanaler, signalstoffer transportører, og gap Junction molekyler. For å støtte denne dynamiske Flux, astrocytter, som neurons, stole på tett koordinert og effektiv intracellulære transport. I motsetning til neurons, der intracellulære smugling har blitt omfattende avgrenset, mikrotubulinettverket transport i astrocytter har vært mindre studert. Likevel, EXO-og endocytic smugling av celle membran proteiner og intracellulære organelle transport appartefakter astrocytter ‘ normal biologi, og disse prosessene er ofte påvirket i sykdom eller som følge av skade. Her presenterer vi en grei protokoll til kultur av høy kvalitet murine astrocytter, å fluorescensmerkete etikett astrocytic proteiner og organeller av interesse, og å registrere deres intracellulære transport dynamikk ved hjelp av time-lapse konfokalmikroskopi mikroskopi. Vi viser også hvordan du kan trekke ut og kvantifisere relevante transport parametre fra ervervet filmene ved hjelp av tilgjengelig bildeanalyse programvare (dvs. ImageJ/FIJI) plugins.

Introduction

Astrocytter er de mest tallrike cellene i det voksne sentralnervesystemet, hvor de utfører unike utviklings-og homøostatisk funksjoner¹. Astrocytter modulere Synaptic utvikling gjennom direkte kontakt med pre-og postsynaptic terminaler som en del av Tri-partite synapse, som inneholder signalstoffer reseptorer, transportører, og celle vedheft molekyler som letter synapse formasjon og Nevron-astrocytt kommunikasjon². I tillegg astrocytter aktivt kontrollere Synaptic overføring og hindre neuronal excitotoxicity ved raskt å fjerne eksitatoriske nevrotransmittere fra Synaptic kløft, resirkulering nevrotransmittere, og deltar i Synaptic beskjæring^{3 , 4} andre priser ^{, 5} andre priser ^{, 6}. for å aktivere disse svært interaktive funksjoner, astrocytter kommunisere seg imellom, med andre gliacellene celler, og med neurons gjennom spesialiserte membran proteiner, inkludert celle vedheft molekyler, akvaporiner, ion kanaler, signal-transportører, og gap knutepunkt molekyler. Astrocytter aktivt endre overflaten nivåer av disse proteinene som svar på svingninger i deres intra-og ekstracellulære miljø⁷. Videre endringer i nivåer og fordeling av mitokondrier, lipid dråper, og degradative og gjenvinning organeller modulere energiforsyning, metabolitten tilgjengelighet, og cellulære clearing prosesser som er avgjørende for astrocytt funksjon og Overlevelse.

De dynamiske endringene i membran protein og organelle smugling og posisjonering i astrocytter er tilrettelagt av den felles funksjon av motor proteiner og adaptere som fremmer Last motilitet^8,9. Tilsvarende er overflate nivåer av membran proteiner modulert gjennom internalisering og resirkulering hendelser¹⁰. Disse cargos transporteres via en intrikat nettverk av utgangen, mikrotubuli, og muligens mellomliggende filamenter spor⁸. Studier basert på immunofluorescence farging av end-binding protein 1 (EB1), som akkumuleres på den voksende mikrotubulinettverket pluss ender, tyder på at i astrocytter bunter av mikrotubuli stråle ut fra perinucleus og forlenge deres pluss ende mot periferien¹¹. Men en omfattende undersøkelse av organiseringen og polariteten til mikrotubuli og andre cytoskjelettkomponenter elementer ved hjelp av Live-celle Imaging mangler fortsatt. Mens mange av mekanismene bak dynamikken i organeller og membran proteiner har blitt grundig studert i neurons og andre celletyper, er Last motilitet i astrocytter mindre godt forstått. De fleste av våre nåværende kunnskaper om endringer i protein og organelle distribusjon i astrocytter er basert på tradisjonell antistoff-basert merking av fast forberedelse, som utelukker presis romlig og timelig undersøkelse av Last dynamikk^7, det er ¹².

Her beskriver vi en metode for å merke membran proteiner og organeller for Live Imaging i høy renhet primære mus astrocytt kulturer. Ved hjelp av denne protokollen, gir vi eksempler der vi spore dynamisk lokalisering av grønne fluorescerende protein (GFP)-Tagged membran proteiner i transfekterte astrocytter, inkludert gapet krysset protein connexin 43 (Cx43-GFP) og eksitatoriske aminosyre transporter 1 (EAAT1-GFP). Vi beskriver også bruken av en fluorescerende acidotropic sonde for å visualisere Sure organeller og følge deres dynamikk i menneskehandel i live astrocytter. Til slutt viser vi hvordan du analyserer data for tidsforløp for å trekke ut og evaluere transport parametere for individuelle cargos.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført med godkjennelse av University of North Carolina i Chapel Hill Animal Care and use Committee (IACUC). 1. Brain disseksjon og kultur av primær mus astrocytter Merk: følgende protokoll ble tilpasset fra publiserte metoder, som følger den opprinnelige prosedyren utviklet av McCarthy og deVellis13,14,15. Blandet cellekulturer av McCarthy/deVelli…

Representative Results

Protokollen for å etablere primær mus MD astrocytter skissert ovenfor bør gi reproduserbar, høy kvalitet kulturer. Selv om kulturer i utgangspunktet inneholder en blanding av astrocytter, fibroblaster og andre gliacellene celler, inkludert mikroglia og oligodendrocytes (figur 1bi, BIV; røde pilspisser), minimerer tillegg av AraC til den blandede KULTUREN mellom DIV5-DIV7 spredning av disse miljøgifter celler. Den kombinerte AraC behandling og risting-basert rensing str…

Discussion

Her beskriver vi en eksperimentell tilnærming til å uttrykke, visualisere og spore fluorescensmerkete merkede organeller og membran proteiner av interesse ved hjelp av time-lapse video mikroskopi i høy renhet primær mus kortikale MD astrocytter. Vi skisserer også en metodikk for måling av partikkel dynamikk. Direkte visualisering av protein og organelle dynamikk i primære astrocytter gir et kraftig verktøy for å studere regulering av intracellulære transport i disse cellene in vitro.

<p class="jove_content"…

Materials

2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
Benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	75-203-637	Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water	Gen Clone	25-511
Cell Culture Microscope	Zeiss	WSN-AXIOVERT A1	Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside	Sigma	C1768-100MG	(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI	Sigma	D9542-5MG	Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope	Zeiss		Stemi 305
Dissecting Scissors	F.S.T	14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Fine Tip Tweezers	F.S.T	11254-20	Style #5
Fluorescence light source	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
GFAP antibody	Cell Signaling	3670S	GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps	F.S.T	11054-10	Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	Magnesium and calcium free
Imaging Media	Life Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x)	Gen Clone	25-512
Phosphate Buffered Saline (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200072
Vacuum-Driven Filter Systems	Olympus Plastics	25-227	500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight	Roboz	RS-5620