המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים
Summary
כאן אנו מתארים בשיטת הדמיה לחיות מחוץ לתמונה כדי להמחיש הובלה תאיים של אורגלים וסחר של חלבונים קרום פלזמה ב astrocytes מורטין. פרוטוקול זה מציג גם מתודולוגיה לניתוח תמונה כדי לקבוע מסלולים להובלת מטענים וקינטיקה.
Abstract
Astrocytes הם בין סוגי התאים הנפוצים ביותר במוח המבוגר, שם הם משחקים תפקידים מרכזיים בריבוי של פונקציות. כשחקן מרכזי בהומאוסטזיס המוח, האסטרוציטים לספק נוירונים עם מטבוליטים חיוניים מאגר המים, יונים, ו גלוטמט. מרכיב אינטגרלי של “tri-פרטיטה” סינפט, אסטרוציטים הם גם קריטיים היווצרות, גיזום, תחזוקה, ואפנון של הסינפסות. כדי להפעיל פונקציות אינטראקטיביות מאוד אלה, אסטרוציטים לתקשר בינם לבין עצמם עם תאים גליה אחרים, נוירונים, המוח ולוח הסביבה באמצעות המון חלבונים ממברנה מיוחדים הכוללים תא מולקולות הדבקה, אקואפונס, ערוצי יונים, מובילי נוירוטרנסמיטר ומולקולות של צומת הפער. כדי לתמוך השטף הדינמי הזה, astrocytes, כמו נוירונים, להסתמך על תחבורה מתואמת היטב ויעיל הובלה תאיים. בניגוד לנוירונים, שם הסחר התאיים היתה מבוססת בהרחבה, הובלה microtubule דורית מבוסס אסטרוציטים כבר נחקרו פחות. עם זאת, הסחר exo-ו endocytic של ממברנות התא חלבונים והתחבורה התאיים ארגונית הובלה בביולוגיה נורמלית, תהליכים אלה מושפעים לעתים קרובות במחלה או בתגובה לפציעה. כאן אנו מציגים פרוטוקול ישיר לתרבות האסטרוציטים באיכות גבוהה, כדי לסמן חלבונים אסטרוציטוטיים התווית והאורגלים של עניין, ולהקליט את הדינמיקה התחבורה התאיים שלהם באמצעות הזמן לשגות במיקרוסקופ קונפוקלית. כמו כן, אנו מדגימים כיצד לחלץ ולכמת את פרמטרי התחבורה הרלוונטיים מהסרטים הנרכשים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה (כגון, ImageJ/פיג’י) תוספים.
Introduction
Astrocytes הם התאים השופעים ביותר במערכת העצבים המרכזית למבוגרים, שם הם מבצעים ייחודי התפתחותית פונקציות הומסטטיות1. Astrocytes לווסת את ההתפתחות הסינפטית באמצעות מגע ישיר עם מסופים טרום ו פוסט סינפטית במסגרת סינפטה משולש, אשר מכיל קולטני הנוירוטרנסמיטר, מובילים, תא מולקולות הדבקה המקלים על היווצרות סינפסה והתקשורת האסטרוציטותא2. בנוסף, האסטרוציטים באופן פעיל לשלוט שידור סינפטית ולמנוע מפני הזדקנות העצבים העצבית על ידי הסרה מהירה של נוירוטרנסמיטרים מתוך שסוע סינפטית, מיחזור נוירוטרנסמיטורים, והשתתפות בגיזום סינפטית3 , ד , מיכל 5 , 6. כדי לאפשר אלה פונקציות אינטראקטיביות מאוד, האסטרוציטים לתקשר בינם לבין עצמם, עם תאים גליה אחרים, עם נוירונים באמצעות חלבונים ממברנה מיוחדים, כולל מולקולות הדבקה התא, aquפורטל, ערוצי יונים, מובילי הנוירוטרנסמיטר ומולקולות של צומת הפער. Astrocytes פעיל לשנות את רמות פני השטח של חלבונים אלה בתגובה תנודות בסביבה הפנים והחילוץ שלהם7. יתר על כן, שינויים ברמות והפצה של המיטו, טיפות ליפיד, ו degradative ומיחזור אורגלים לווסת את אספקת האנרגיה, זמינות מטבוליט, ותהליכי סליקה סלולריים החיוניים לפונקציה אסטרוציט ו ישרדות.
השינויים הדינאמיים בחלבון ממברנה ובסחר בנשים ומיצוב באסטרוציטים מקדמים את הפונקציה מתואמת של חלבונים ומתאמים מוטוריים המעודדים תנועתיות מטענים8,9. באופן דומה, רמות פני השטח של חלבונים ממברנה מאופנן דרך הפנמה ומיחזור אירועים10. אלה מטענים מועברים באמצעות רשת מורכבת של actin, microtubules, ואולי ביניים רצועות שירים8. מחקרים המבוססים על כתמים immunofluorescence של הקצה מחייב חלבון 1 (EB1), אשר מצטבר על מיקרוכדורית הגוברת ומסתיים, מציע כי בצרורות אסטרוציטים של microtubules מקרין החוצה מתוך החוצה ולהאריך את קצה הפלוס שלהם לכיוון מפריפריה11. עם זאת, בדיקה מקיפה של הארגון וקוטביות של microtubules ואלמנטים ציטולדים אחרים באמצעות הדמיה תא חי עדיין חסר. בעוד רבים של המנגנונים המשמשים את הדינמיקה של אורגלים וחלבונים ממברנה נחקרו בהרחבה בנוירונים וסוגי תאים אחרים, תנועתיות מטענים ב אסטרוציטים הוא פחות טוב מובן. רוב הידע הנוכחי שלנו על שינויים חלבון ו אורגונל התפלגות ב אסטרוציטים מבוסס על מסורתי נוגדן מבוסס תיוג של הכנה קבועה, אשר מונע בדיקה מרחבית וזמני מדויק של דינמיקה מטענים7, . שתיים עשרה
כאן, אנו מתארים שיטה לתייג חלבונים הממברנה ואורגלים עבור הדמיה חיה בתרבויות גבוהה העכבר הראשי אסטרוציט הטוהר. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מספקים דוגמאות שבו אנו מעקב אחר הלוקליזציה הדינמי של חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-מתויגים חלבונים ממברנה ב astrocytes הטרנסתאי, כולל הפער הפערים חלבון קונשין 43 (Cx43-GFP) ואת חומצת האמינו המתומנת טרנספורטר 1 (EAAT1-GFP). אנו גם לתאר את השימוש של החללית הניאון ac, בדיקה כדי להמחיש אורגלות חומצי ולעקוב אחר הדינמיקה שלהם הסחר בחיים astrocytes. בסופו של דבר, אנו להדגים כיצד לנתח את הנתונים לשגות זמן כדי לחלץ ולהעריך את הפרמטרים התחבורה עבור cargos בודדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים גישה ניסיונית לבטא, להמחיש, ולעקוב אחר מתויג fluorescently וחלבונים ממברנה של עניין באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות ב-high-טוהר העכבר הראשי בקליפת המין הראשונית MD. אנו גם מתווה מתודולוגיה למדידת דינמיקת חלקיקים. ויזואליזציה ישירה של חלבון ו אורגונל דינמיקה ב אסטרוציטים הראשי מספ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DNL נתמך על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בבית הספר לרפואה בצ היל (UNC) בתור מלומד סימונס. TWR נתמך על ידי UNC הכנה גרנט ראשי 25 GM089569. העבודה באמצעות מרכז מיקרוסקופ הליבה UNC המרכז היה נתמך, בין השאר, על ידי מימון של NIH-NINDS מרכז המחקר תמיכה מענק P30 NS045892 ו NIH-מוגבלות התפתחותית מרכז מחקר התפתחותי תמיכה מענק U54 HD079124.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
- Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
- Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).
- Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
- Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
- Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
- Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
- Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).
- Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
- Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
- . IJ KymoToolBox Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016)
