Визуализация и анализ внутриклеточного переноса органелл и других грузов в астроцитах
Summary
Здесь мы описываем метод живой визуализации in vitro для визуализации внутриклеточного переноса органелл и оборота плазменных мембранных белков в murine astrocytes. В этом протоколе также представлена методология анализа изображений для определения маршрутов грузовых перевозок и кинетики.
Abstract
Астроциты являются одними из наиболее распространенных типов клеток во взрослом мозге, где они играют ключевую роль в множественности функций. Как центральный игрок в гомеостаз мозга, астроциты питания нейронов с жизненно важными метаболитами и буфервой внеклеточной воды, ионов и глутамата. Неотъемлемый компонент синапса «трипартита», астроциты также имеют решающее значение в формировании, обрезке, обслуживании и модуляции синапсов. Для того чтобы позволить эти высоки взаимодействуюные функции, астроциты связывают между собой и с другими глиальными клетками, невронами, сосудом мозга, и внеклеточной окружающей средой через множество специализированных протеинов мембраны которые включают клетки молекулы адгезии, аквапорины, ионные каналы, нейромедиаторные транспортеры и молекулы разрывных узлов. Для поддержки этого динамического потока астроциты, как и нейроны, полагаются на тесно скоординированный и эффективный внутриклеточный транспорт. В отличие от нейронов, где внутриклеточный оборот был широко разграничен, микротубулы на основе транспорта в астроцитах были менее изучены. Тем не менее, экзо- и эндоцитарный оборот клеточных мембранных белков и внутриклеточного транспортировки органеллы организует нормальную биологию астроцитов, и эти процессы часто страдают при болезни или в ответ на травму. Здесь мы представляем простой протокол для культуры высокого качества муринааааа, чтобы флуоресцентно маркировать астроцитические белки и органеллы, представляющие интерес, и записывать их внутриклеточной динамики транспорта с помощью замедленной конфокальной микроскопии. Мы также демонстрируем, как извлечь и количественно определить соответствующие параметры транспортировки из приобретенных фильмов с помощью доступных плагинов анализа изображений (т.е. ImageJ/FIJI).
Introduction
Астроциты являются наиболее распространенными клетками в центральной нервной системе взрослого человека, где они выполняют уникальные функции развития и гомеостатических1. Астроциты модулируют синаптической развитие через прямой контакт с до- и постсинаптическими терминалами как часть трехпартитного синапса, который содержит нейромедиаторные рецепторы, транспортеры и молекулы клеточной адгезии, которые способствуют формированию синапса и нейрон-астроцитов связи2. Кроме того, астроциты активно контролируют синаптической передачи и предотвратить возневнищее экситотоксичность путем быстрого удаления возбуждающих нейротрансмиттеров из синаптической расщелины, рециркуляции нейротрансмиттеров, и участие в синаптической обрезкой3 , 4 , 5 , 6. Для того чтобы включить эти высоки взаимодействуючие функции, астроциты связывают между собой, с другими глиальными клетками, и с нейронами через специализированные протеины мембраны, включая молекулы стегезии клетки, aquaporins, каналы иона, нейромедиатор транспортеров, и разрыв узел молекул. Астроциты активно меняют поверхностные уровни этих белков в ответ на колебанияих внутри- и внеклеточной среды 7. Кроме того, изменения в уровнях и распределении митохондрий, липидных капель, а также деградативных и рециркуляционных органелл модулировать энергоснабжение, наличие метаболита и клеточных процессов очистки, которые имеют важное значение для астроцитов функции и Выживания.
Динамические изменения в мембранном белке и торговле органеллами и позиционировании в астроцитах способствуют согласованной функции моторных белков и адаптеров, которые способствуют подвижности грузов8,9. Аналогичным образом, поверхностные уровни мембранных белков модулируются через интернализацию и переработку событий10. Эти грузы перевозятся через сложную сеть актина, микротрубочки и, возможно, промежуточные нити треков8. Исследования, основанные на иммунофлуоресценции окрашивания конечной связывания белка 1 (EB1), который накапливается на растущей микротрубочки плюс концы, показывают, что в астроцитах пучки микротрубок излучают из периноклея и расширяют их плюс конец к периферии11. Тем не менее, комплексное изучение организации и полярности микротрубок и других цитоскелетных элементов с использованием живой клетки изображения по-прежнему отсутствует. В то время как многие из механизмов, лежащих в основе динамики органелл и мембранных белков, были широко изучены в нейронах и других типах клеток, подвижность груза в астроцитах менее хорошо понята. Большинство наших современных знаний об изменениях в распределении белков и органелл в астроцитах основано на традиционной маркировке фиксированной препаратом на основе антител, что исключает точное пространственное и временное изучение динамики груза7, 12.
Здесь мы описываем метод маркировки мембранных белков и органелл для живой визуализации в культурах астроцитов высокой чистоты. Используя этот протокол, мы приведиваем примеры, в которых мы отслеживаем динамическую локализацию зеленого флуоресцентного белка (GFP) помеченных мембранных белков в трансинфицированных астроцитах, включая разрыв соединения белка connexin 43 (Cx43-GFP) и возбуждающей аминокислоты транспортер 1 (EAAT1-GFP). Мы также описываем использование флуоресцентного ацидотропного зонда для визуализации кислых органелл и следованизаих их динамике торговли живыми астроцитами. Наконец, мы демонстрируем, как анализировать данные замедленного управления для извлечения и оценки транспортных параметров для отдельных грузов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем экспериментальный подход к выражению, визуализации и отслеживанию флуоресцентно помеченных органелл и мембранных белков, представляющих интерес, используя видеомикроскопию замедленного времени в высокой чистоте первичных корковых астроцитов MD мыши. Мы также изла…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DNL была поддержана Университетом Северной Каролины в Чапел-Хилл (UNC) Школа медицины в качестве стипендиата Симмонса. TWR была поддержана КООН PREP Грант R25 GM089569. Работа с использованием КООН Центр нейронауки Центр Микроскоп Микроскоп Основные фонд был поддержан, в частности, за счет финансирования со стороны NIH-NINDS Неврология центр поддержки Грант P30 NS045892 и NIH-NICHD интеллектуальных и развития инвалидов научно-исследовательский центр Поддержка Грант U54 HD079124.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
- Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
- Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).
- Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
- Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
- Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
- Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
- Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).
- Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
- Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
- . IJ KymoToolBox Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016)
