성상 세포에서 세포기관 및 기타 화물의 세포내 운송 시각화 및 분석
Summary
여기에서 우리는 세포기관의 세포내 수송 및 뮤린 성상 세포에 있는 혈장 막 단백질의 인신 매매를 구상하는 시험관 내 살아있는 화상 진찰 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 또한 화물 운송 일정 및 역학을 결정하는 이미지 분석 방법론을 제시합니다.
Abstract
성상 세포는 성인 두뇌에 있는 가장 풍부한 세포 모형 중 입니다, 기능의 복합성에서 중요한 역할을 하는 곳에. 뇌 항상성의 중심 플레이어로서, 성상 세포는 중요한 대사 산물과 세포 외 물, 이온, 및 글루타민산염과 뉴런을 공급합니다. “삼중 분” 시냅스의 필수적인 구성 요소인 성상 세포는 시냅스의 형성, 가지 치기, 유지 보수 및 변조에도 중요합니다. 이러한 고도의 상호 작용 기능을 가능하게하기 위해, 성상 세포는 자신과 다른 신경교 세포와 통신, 뉴런, 뇌 혈관, 세포 세포를 포함하는 전문 막 단백질의 무리를 통해 세포 외 환경 접착 분자, 아쿠아포린, 이온 채널, 신경 전달 물질 수송기 및 갭 접합 분자. 이 동적 플럭스를 지원하기 위해, 성상 세포, 뉴런처럼, 밀접하게 조정하고 효율적인 세포 내 수송에 의존. 세포 내 인신 매매가 광범위하게 묘사 된 뉴런과 는 달리, 성상 세포에서 미세 관 기반 의 수송은 덜 연구되었습니다. 그럼에도 불구하고, 세포막 단백질과 세포내 세포기관 수송의 엑소좀 및 내분비 인신 매매는 성상 세포의 정상적인 생물학을 조율하고, 이 프로세스는 수시로 질병에서 또는 상해에 응하여 영향을 받습니다. 여기에서 우리는 고품질 뮤린 점성체를 배양하고, 형광성 성상 세포 단백질 및 관심 있는 세포기관에 표시하고, 시간 경과 공초점 현미경 을 사용하여 세포내 수송 역학을 기록하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다. 또한 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ/FIJI) 플러그인을 사용하여 획득한 영화에서 관련 전송 매개 변수를 추출하고 정량화하는 방법을 시연합니다.
Introduction
성상 세포는 성인 중추 신경계에서 가장 풍부한 세포로 독특한 발달 및적시 성 기능을 수행합니다 1. 성상 세포는 시냅스 형성을 용이하게 하는 신경 전달 물질 수용체, 수송기 및 세포 접착 분자를 포함하는 트라이 파르트 족속 시냅스의 일환으로 전과 후 발착 단자와직접 접촉을 통해 시냅스 발달을 조절합니다. 및 뉴런-성상세포 통신2. 또한, 성상세포는 시냅스 전달을 능동적으로 제어하고 시냅스 갈라진 자로부터 흥분성 신경 전달 물질을 신속하게 제거하고 신경 전달 물질을 재활용하며 시냅스 가지치기에 참여함으로써 신경 흥분성 물질을 방지합니다3 , 4개 , 5개 , 6. 이러한 고도로 상호 작용 기능을 가능하게하기 위해 성상 세포는 다른 신경교 세포와 세포 접착 분자, 아쿠아 포린, 이온 채널을 포함한 특수 막 단백질을 통해 뉴런과 통신합니다. 신경 전달 물질 수송기, 및 갭 접합 분자. 성상 세포는 적극적으로 그들의 세포 내 및 세포 외 환경에서 변동에 응하여이 단백질의 표면 수준을 변경합니다 7. 또한, 미토콘드리아, 지질 방울, 분해 및 재활용 소기관의 수준 과 분포의 변화는 성상 세포 기능에 필수적인 에너지 공급, 대사 산물 가용성 및 세포 정화 과정을 조절하고, 생존.
막 단백질 및 세포세포 인신 매매 및 성상 세포에서의 위치의 동적 변화는 화물 운동성을 촉진하는 모터 단백질및 어댑터의 공동 기능에 의해 촉진된다 8,9. 유사하게, 막 단백질의 표면 수준은 내재화 및 재활용 이벤트10을통해 변조된다. 이 화물은 액틴, 미세 관 및 아마도 중간 필라멘트 트랙8의복잡한 네트워크를 통해 수송됩니다. 성장하는 미세소관 플러스 끝에 축적되는 말단 결합 단백질 1 (EB1)의 면역 형광 염색에 기초한 연구 결과는, 미세소관의 성상 세포 번들이 회중에서 방사하고 그들의 플러스 끝을 향해 확장한다는 것을 건의합니다 주변11. 그러나, 살아있는 세포 화상 진찰을 사용하여 microtubules 및 그밖 cytoskeletal 요소의 조직 그리고 극성의 포괄적인 검사는 아직도 부족합니다. 세포기관과 막 단백질의 역학의 근본적인 기계장치의 많은 것이 신경세포 및 그밖 세포 모형에서 광범위하게 공부되는 동안, 성상 세포에 있는 화물 운동성은 보다 적게 잘 이해됩니다. 성상 세포에서 단백질 과 세포세포 분포의 변화에 대한 우리의 현재 지식의 대부분은화물 역학의 정확한 공간 및 시간 적 검사를 배제 고정 제제의 전통적인 항체 기반 라벨링에 기초7, 12.
여기서, 우리는 고순도 원발성 마우스 성상 세포 배양에서 살아있는 이미징을 위한 막 단백질 및 소기관표지 방법을 기술한다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 갭 접합 단백질 코넥신 43 (Cx43-GFP) 및 흥분성 아미노산을 포함하여 형질 감염 된 성상 세포에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 막 단백질의 동적 국소화를 추적하는 예를 제공합니다. 수송기 1 (EAAT1-GFP). 우리는 또한 산성 세포기관을 시각화하고 살아있는 성상 세포에서 그들의 인신 매매 역학을 따르기 위해 형광 산성 종자 프로브의 사용을 설명합니다. 마지막으로, 시간 경과 데이터를 분석하여 개별 화물에 대한 운송 매개 변수를 추출하고 평가하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서, 우리는 고순도 1 차적인 마우스 피질 MD 성상 세포에 있는 시간 경과 비디오 현미경 검사법을 사용하여 관심있는 형광성 으로 표를 붙인 세포기관 및 막 단백질을 표현하고, 구상하고, 추적하는 실험적인 접근을 기술합니다. 또한 입자 역학을 측정하는 방법론도 간략하게 설명합니다. 1 차 적인 성상 세포에 있는 단백질과 세포기관 역학의 직접적인 시각화는 시험관내 이 세포에 있는 세?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DNL은 채플 힐 (UNC) 의학 대학에서 시몬스 학자로 노스 캐롤라이나 대학에 의해 지원되었다. TWR은 UNC 준비 그랜트 R25 GM089569에 의해 지원되었다. UNC 신경과학 센터 현미경 코어 시설을 이용한 작업은 NIH-NINDS 신경과학 센터 지원 보조금 P30 NS045892 및 NIH-NICHD 지적 발달 장애 연구 센터 지원 보조금 U54의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다. HD079124.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
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