Visualisering og analyse af intracellulær transport af organelles og andre Cargos i astrocytter
Summary
Her beskriver vi en in vitro-Live-imaging metode til at visualisere intracellulær transport af organeller og handel med plasma membran proteiner i murine astrocytter. Denne protokol præsenterer også en billedanalyse metode til at bestemme fragttransport ruter og kinetik.
Abstract
Astrocytter er blandt de mest udbredte celletyper i den voksne hjerne, hvor de spiller nøgleroller i en mangfoldighed af funktioner. Som en central aktør i hjernens homøostase leverer astrocytter neuroner med vitale metabolitter og buffer ekstracellulært vand, ioner og glutamat. En integreret del af “Tri-Arts” synapse, astrocytter er også afgørende i dannelsen, beskæring, vedligeholdelse, og graduering af synapser. For at aktivere disse meget interaktive funktioner kommunikerer astrocytter indbyrdes og med andre gliale celler, neuroner, hjernens vaskulatur og det ekstracellulære miljø gennem et væld af specialiserede membran proteiner, der omfatter celle adhæsionsmolekyler, aquaporiner, ionkanaler, neurotransmitter transportører og Gap Junction molekyler. For at støtte denne dynamiske flux, astrocytter, ligesom neuroner, stole på stramt koordineret og effektiv intracellulær transport. I modsætning til neuroner, hvor intracellulær handel er blevet udførligt afgrænset, microtubule-baserede transport i astrocytter har været mindre undersøgt. Ikke desto mindre, EXO-og endocytisk handel med celle membran proteiner og intracellulære organelle transport orkestrere astrocytter ‘ normale biologi, og disse processer er ofte påvirket i sygdom eller som reaktion på skade. Her præsenterer vi en ligetil protokol til kultur høj kvalitet murine astrocytter, at fluorescently label astrocytiske proteiner og organeller af interesse, og at registrere deres intracellulære transport dynamik ved hjælp af time-lapse confokale mikroskopi. Vi demonstrerer også, hvordan man udtrækker og kvantificerer relevante transport parametre fra de erhvervede film ved hjælp af tilgængelige billedanalyse software (dvs., ImageJ/FIJI) plugins.
Introduction
Astrocytter er de mest rigelige celler i den voksne centrale nervesystem, hvor de udfører unikke udviklingsmæssige og homeostatiske funktioner1. Astrocytter moduter synaptisk udvikling gennem direkte kontakt med præ-og postsynaptiske terminaler som en del af Tri-Arts synapse, som indeholder neurotransmitter receptorer, transportører, og celle adhæsion molekyler, der letter synapse dannelse og neuron-astrocyt kommunikation2. Desuden, astrocytter aktivt kontrollere synaptisk transmission og forhindre neuronal excitotoksicitet ved hurtigt at fjerne excitatoriske neurotransmittere fra den synaptiske kløft, genbrug neurotransmittere, og deltager i synaptisk beskæring3 , 4 , 5 , 6. for at aktivere disse meget interaktive funktioner kommunikerer astrocytter indbyrdes, med andre gliale celler og med neuroner gennem specialiserede membran proteiner, herunder celle vedhæftnings molekyler, aquaporiner, ionkanaler, neurotransmitter transportører og Gap Junction molekyler. Astrocytter ændrer aktivt overflade niveauerne af disse proteiner som reaktion på udsving i deres intra-og ekstracellulære miljø7. Endvidere, ændringer i niveauer og fordeling af mitokondrier, lipid dråber, og nedbrydelse og genanvendelse organeller modutere energiforsyningen, metabolismen tilgængelighed, og cellulære clearing processer, der er afgørende for astrocyt funktion og Overlevelse.
De dynamiske ændringer i membran protein og organelle handel og positionering i astrocytter lettes ved den samordnede funktion af motor proteiner og adaptere, der fremmer lasten motilitet8,9. Tilsvarende er overflade niveauer af membran proteiner moduleret gennem internalisering og genbrug begivenheder10. Disse Cargos transporteres via et indviklet netværk af actin, microtubuler, og eventuelt mellemliggende filamenter spor8. Undersøgelser baseret på immunofluorescens farvning af bindende protein 1 (EB1), som akkumuleres ved den voksende mikrotubule plus ender, tyder på, at i astrocytter bundter af microtubuli udstråler ud fra perinucleus og udvide deres plus ende mod periferi11. Men, en omfattende undersøgelse af organisation og polaritet af microtubuler og andre cytoskelet elementer ved hjælp af Live-Cell Imaging er stadig mangler. Mens mange af de mekanismer, der ligger til grund for dynamikken i organeller og membran proteiner er blevet grundigt undersøgt i neuroner og andre celletyper, er Cargo motilitet i astrocytter mindre godt forstået. De fleste af vores nuværende viden om ændringer i protein og organelle fordeling i astrocytter er baseret på traditionelle antistof-baserede mærkning af fast præparat, som udelukker præcis rumlig og tidsmæssig undersøgelse af lasten Dynamics7, 12.
Her beskriver vi en metode til at mærke membran proteiner og organeller til levende billeddannelse i høj renhed primær mus astrocyt kulturer. Ved hjælp af denne protokol giver vi eksempler, hvor vi sporer den dynamiske lokalisering af grønt fluorescerende protein (gfp)-mærkede membran proteiner i transficeret astrocytter, herunder Gap Junction protein connexin 43 (Cx43-gfp) og excitatoriske aminosyre transporter 1 (EAAT1-GFP). Vi beskriver også brugen af en fluorescerende acidotropic sonde til at visualisere sure organeller og følge deres handel dynamik i levende astrocytter. Endelig viser vi, hvordan man analyserer tidsforskudt data for at udtrække og evaluere transport parametre for individuelle Cargos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en eksperimentel tilgang til at udtrykke, visualisere og spore fluorescently mærkede organeller og membran proteiner af interesse ved hjælp af time-lapse video mikroskopi i høj renhed primær mus kortikale MD astrocytter. Vi skitserer også en metode til måling af partikel dynamik. Direkte visualisering af protein og organelle dynamik i primære astrocytter giver et kraftfuldt værktøj til at studere reguleringen af intracellulær transport i disse celler in vitro.
Metode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DNL blev støttet af University of North Carolina på Chapel Hill (UNC) School of Medicine som en Simmons-forsker. TWR blev understøttet af UNC PREP Grant R25 GM089569. Arbejde ved hjælp af UNC Neuroscience Center Microscopy Core facilitet blev støttet, delvis, ved at støtte fra NIH-NINDS Neuroscience Center support Grant P30 NS045892 og NIH-NICHD intellektuelle og udviklingsmæssige handicap Research Center støtte Grant U54 HD079124.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
- Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
- Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).
- Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
- Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
- Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
- Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
- Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).
- Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
- Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
- . IJ KymoToolBox Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016)
