एस्ट्रोसाइट्स में ऑर्गेनेल्स और अन्य कार्गो के इंट्रासेल्यूलर ट्रांसपोर्ट का दृश्य और विश्लेषण करना
Summary
यहाँ हम organelles के intracellular परिवहन और murine astrocytes में प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की तस्करी कल्पना करने के लिए एक इन विट्रो लाइव-इमेजिंग विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल भी कार्गो परिवहन itineraries और गतिकी का निर्धारण करने के लिए एक छवि विश्लेषण पद्धति प्रस्तुत करता है।
Abstract
Astrocytes वयस्क मस्तिष्क में सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार के बीच हैं, जहां वे कार्यों की एक बहुतायत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. मस्तिष्क homeostasis में एक केंद्रीय खिलाड़ी के रूप में, astrocytes महत्वपूर्ण चयापचयों और बफर extracellular पानी, आयनों, और ग्लूटामेट के साथ न्यूरॉन्स की आपूर्ति. “त्रि-पक्षीय” synapse का एक अभिन्न घटक, astrocytes भी गठन में महत्वपूर्ण हैं, pruning, रखरखाव, और synapses के मॉडुलन. इन अत्यधिक इंटरैक्टिव कार्यों को सक्षम करने के लिए, astrocytes आपस में और अन्य glial कोशिकाओं के साथ संवाद, न्यूरॉन्स, मस्तिष्क vascuature, और विशेष झिल्ली प्रोटीन की एक भीड़ के माध्यम से extracellular पर्यावरण है कि सेल शामिल आसंजन अणुओं, एक्वापोरिन, आयन चैनल, न्यूरोट्रांसमीटर ट्रांसपोर्टर, और अंतराल जंक्शन अणुओं. इस गतिशील प्रवाह का समर्थन करने के लिए, astrocytes, न्यूरॉन्स की तरह, कसकर समन्वित और कुशल intracellular परिवहन पर भरोसा करते हैं. न्यूरॉन्स के विपरीत, जहां intracellular तस्करी बड़े पैमाने पर रेखांकित किया गया है, astrocytes में microtubule आधारित परिवहन कम अध्ययन किया गया है. फिर भी, कोशिका झिल्ली प्रोटीन और इंट्रासेल्यूलर आर्गेनेल ट्रांसपोर्ट के एक्सो और एंडोसाइटिक तस्करी एस्ट्रोसाइट्स के सामान्य जीव विज्ञान का आयोजन करती है, और ये प्रक्रियाएं अक्सर बीमारी में या चोट के जवाब में प्रभावित होती हैं। यहाँ हम संस्कृति उच्च गुणवत्ता murine astrocytes के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल प्रस्तुत, फ्लोरोसेंट लेबल astrocytic प्रोटीन और ब्याज के organelles के लिए, और समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर उनके intracellular परिवहन गतिशीलता रिकॉर्ड करने के लिए. हम यह भी प्रदर्शित कैसे निकालने के लिए और उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (यानी, ImageJ/FIJI) plugins का उपयोग कर प्राप्त फिल्मों से प्रासंगिक परिवहन मापदंडों की मात्रा निर्धारित करने के लिए.
Introduction
Astrocytes वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं, जहां वे अद्वितीय विकास और homeostatic कार्यों 1प्रदर्शन कर रहे हैं. एस्ट्रोसाइट्स त्रि-पक्षीय synapse के भाग के रूप में पूर्व और पदों के साथ सीधे संपर्क के माध्यम से synaptic विकास modulate, जो न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स, ट्रांसपोर्टरों, और सेल आसंजन अणुओं है कि synapse गठन की सुविधा शामिल और न्यूरॉन-एस्ट्रोसाइट संचार2| इसके अलावा, astrocytes सक्रिय रूप से synaptic संचरण को नियंत्रित करने और तेजी से synaptic फांक से उत्तेजक न्यूरोट्रांसमीटर को हटाने के द्वारा न्यूरॉन excitotoxicity को रोकने, रीसाइक्लिंग न्यूरोट्रांसमीटर, और synaptic pruning में भाग लेने3 , 4 , 5 , 6. इन अत्यधिक इंटरैक्टिव कार्यों को सक्षम करने के लिए, एस्ट्रोसाइट्स अन्य ग्लिल कोशिकाओं के साथ, और कोशिका आसंजन अणुओं, एक्वापोरिन, आयन चैनलों सहित विशेष झिल्ली प्रोटीन के माध्यम से न्यूरॉन्स के साथ आपस में संवाद करते हैं, न्यूरोट्रांसमीटर ट्रांसपोर्टर, और अंतराल जंक्शन अणुओं. एस्ट्रोसाइट्स अपने अंतर और बाह्यवातावरण7 में उतार-चढ़ाव के जवाब में इन प्रोटीनों के सतह के स्तर को सक्रिय रूप से बदल ते हैं। इसके अलावा, mitochondria के स्तर और वितरण में परिवर्तन, लिपिड बूंदों, और अपमानजनक और रीसाइक्लिंग organelles modulate ऊर्जा की आपूर्ति, चयापचय उपलब्धता, और सेलुलर समाशोधन प्रक्रियाओं है कि एस्ट्रोसाइट समारोह के लिए आवश्यक हैं और अस्तित्व बचाना.
झिल्ली प्रोटीन और ऑर्गेनेल तस्करी और एस्ट्रोसाइट्स में स्थिति में गतिशील परिवर्तन मोटर प्रोटीन और अनुकूलकों के सम्मिलित कार्य द्वारा मदद करते हैं जो कार्गो गतिशीलताकोबढ़ावा देते हैं8 ,9. इसी प्रकार, झिल्ली प्रोटीन की सतह के स्तर internalization और रीसाइक्लिंग घटनाओं10के माध्यम से संग्राहक रहे हैं. इन कार्गोओं को actin, microtubules, और संभवतः मध्यवर्ती फिलामेंट पटरियों8के एक जटिल नेटवर्क के माध्यम से ले जाया जाता है। अंत बाध्यकारी प्रोटीन 1 (EB1) के इम्यूनोफ्लोरेस धुंधला पर आधारित अध्ययन, जो बढ़ते माइक्रोट्युबल प्लस सिरों पर जमा होता है, सुझाव है कि माइक्रोट्यूबेट्स के बंडलों में पेरिनुक्लियस से बाहर निकलने और उनके प्लस अंत का विस्तार करने के लिए परिधि11| हालांकि, संगठन की एक व्यापक परीक्षा और microtubules और अन्य cytoskeletal तत्वों की ध्रुवता लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग कर अभी भी कमी है. जबकि organelles और झिल्ली प्रोटीन की गतिशीलता अंतर्निहित तंत्र के कई बड़े पैमाने पर न्यूरॉन्स और अन्य कोशिका प्रकार में अध्ययन किया गया है, astrocytes में कार्गो गतिशीलता कम अच्छी तरह से समझा जाता है. एस्ट्रोसाइट्स में प्रोटीन और ऑर्गेनेल वितरण में परिवर्तन के बारे में हमारे वर्तमान ज्ञान के अधिकांश निश्चित तैयारी के पारंपरिक एंटीबॉडी आधारित लेबलिंग पर आधारित है, जो कार्गो गतिशीलता7के सटीक स्थानिक और लौकिक परीक्षा precludes, 12.
यहाँ, हम उच्च शुद्धता प्राथमिक माउस एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों में लाइव इमेजिंग के लिए झिल्ली प्रोटीन और organelles लेबल करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम उदाहरण प्रदान करते हैं जिसमें हम ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) टैग किए गए झिल्ली प्रोटीन के गतिशील स्थानीयकरण को ट्रांसफेक्टेड एस्ट्रोसाइट्स में ट्रैक करते हैं, जिसमें अंतराल जंक्शन प्रोटीन कोनेसिन 43 (Cx43-GFP) और उत्तेजक एमिनो एसिड शामिल हैं ट्रांसपोर्टर 1 (EAAT1-GFP). हम अम्लीय organelles कल्पना और लाइव एस्ट्रोसाइट्स में उनकी तस्करी गतिशीलता का पालन करने के लिए एक फ्लोरोसेंट acidotropic जांच के उपयोग का भी वर्णन. अंत में, हम अलग-अलग कार्गो के लिए परिवहन मापदंडों को निकालने और मूल्यांकन करने के लिए समय चूक डेटा का विश्लेषण करने का तरीका प्रदर्शित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम व्यक्त करने के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन, कल्पना, और ट्रैक फ्लोरोसेंट टैग organelles और ब्याज की झिल्ली प्रोटीन उच्च शुद्धता प्राथमिक माउस cortical एमडी astrocytes में समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DNL एक Simmons विद्वान के रूप में चैपल हिल (यूएनसी) चिकित्सा के स्कूल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था. TWR UNC PREP अनुदान R25 GM089569 द्वारा समर्थित किया गया था. UNC तंत्रिका विज्ञान केंद्र माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा का उपयोग कर काम का समर्थन किया गया था, भाग में, NIH-NINDS तंत्रिका विज्ञान केंद्र सहायता अनुदान P30 NS045892 और NIH-NICHD बौद्धिक और विकासात्मक विकलांगता अनुसंधान केंद्र सहायता अनुदान U54 से वित्त पोषण द्वारा HD079124.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
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