Visualisera och analysera intracellulär transport av organeller och andra laster i astrocyter
Summary
Här beskriver vi en in vitro Live-Imaging metod för att visualisera intracellulär transport av organeller och handel med plasmamembran proteiner i murina astrocyter. Detta protokoll innehåller också en bildanalys metod för att bestämma transport resvägar och kinetik.
Abstract
Astrocyter är bland de vanligast förekommande celltyperna i den vuxna hjärnan, där de spelar nyckelroller i en mångfald av funktioner. Som en central aktör i hjärnan homeostas, astrocyter leverera nervceller med vitala metaboliter och buffert extracellulära vatten, joner, och glutamat. En integrerad del av “Tri-parts” synapsen, astrocyter är också kritiska i bildandet, beskärning, underhåll, och modulering av synapser. För att möjliggöra dessa mycket interaktiva funktioner, astrocyter kommunicera sinsemellan och med andra gliaceller celler, nervceller, hjärnan vasculature, och den extracellulära miljön genom en mängd specialiserade membranproteiner som innehåller cell adhesionsmolekyler, aquaporiner, jonkanaler, signalsubstans transportörer och gap Junction molekyler. För att stödja denna dynamiska Flux, astrocyter, som nervceller, förlita sig på tätt samordnade och effektiva intracellulära transport. Till skillnad från neuroner, där intracellulär människohandel har omfattande avgränsas, har mikrotubule-baserade transporter i astrocyter varit mindre studerade. Icke desto mindre iscengör EXO-och endocytisk handel med cellmembran proteiner och intracellulär organell transport astrocyter normala biologi, och dessa processer är ofta drabbade av sjukdom eller som svar på skada. Här presenterar vi ett enkelt protokoll för att odla hög kvalitet murina astrocyter, att överföras etikett astrocytic proteiner och organeller av intresse, och att spela in sina intracellulära transportdynamik med hjälp av tidsförlopp konfokal mikroskopi. Vi visar också hur man extraherar och kvantifiera relevanta transportparametrar från de förvärvade filmerna med hjälp av tillgängliga bildanalysprogram (dvs ImageJ/FIJI) plugins.
Introduction
Astrocyter är de vanligast förekommande cellerna i den vuxna centralanervsystemet, där de utför unika utvecklings-och homeostatiska funktioner1. Astrocyter modulera synaptisk utveckling genom direkt kontakt med pre-och postsynaptiska terminaler som en del av Tri-partssynapsen, som innehåller signalsubstansen receptorer, transportörer, och cell adhesionsmolekyler som underlättar synapsen bildas och neuron-astrocyte kommunikation2. Dessutom, astrocyter aktivt kontroll synaptisk transmission och förhindra neuronala excitotoxicitet genom att snabbt ta bort excitatoriska neurotransmittorer från den synaptiska spalten, återvinning neurotransmittorer, och deltar i Synaptic beskärning3 , 4 , ,5 , 6. för att möjliggöra dessa mycket interaktiva funktioner, astrocyter kommunicera sinsemellan, med andra gliaceller celler, och med nervceller genom specialiserade membranproteiner, inklusive cell adhesionsmolekyler, aquaporins, jonkanaler, signalsubstansen transportörer och gap Junction molekyler. Astrocyter förändrar aktivt ytnivåerna av dessa proteiner som svar på fluktuationer i deras intraoch extracellulära miljö7. Dessutom, förändringar i nivåer och distribution av mitokonsamerna, lipiddroppar, och nedbrytande och återvinning organeller modulera energiförsörjning, metabolit tillgänglighet, och cellulära Clearing processer som är viktiga för astrocytmodell funktion och Överlevnad.
De dynamiska förändringarna i membranprotein och organell handel och positionering i astrocyter underlättas av den samordnade funktionen av motorproteiner och adaptrar som främjar Last motilitet8,9. På liknande sätt är ytskikt av membranproteiner modulerade genom internalisering och återvinningshändelser10. Dessa laster transporteras via ett intrikat nätverk av Actin, microtubules, och möjligen mellanliggande glödtrådar spår8. Studier baserade på immunofluorescens färgning av slutbindande protein 1 (EB1), som ackumuleras vid den växande mikrotubuli plus ändar, tyder på att i astrocyter buntar av mikrotubuli utstrålar ut från perinucleus och förlänga deras plus änden mot peripheryen11. Emellertid, en omfattande undersökning av organisationen och polaritet av mikrotubuli och andra cytoskeletala element med hjälp av levande cell avbildning saknas fortfarande. Medan många av de mekanismer som ligger bakom dynamiken i organeller och membranproteiner har studerats i stor utsträckning i nervceller och andra celltyper, är Last motilitet i astrocyter mindre väl förstådd. De flesta av våra nuvarande kunskaper om förändringar i protein och organell distribution i astrocyter är baserad på traditionell antikroppsbaserad märkning av fasta preparat, vilket utesluter noggrann rumslig och tidsmässig undersökning av lastdynamik7, 12.
Här beskriver vi en metod för att märka membranproteiner och organeller för levande avbildning i hög renhet primära mus astrocytkulturer. Med hjälp av detta protokoll ger vi exempel där vi spårar den dynamiska lokaliseringen av grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta membranproteiner i transfekterade astrocyter, inklusive gap Junction protein Connexin 43 (Cx43-GFP) och den excitatoriska aminosyran transportör 1 (EAAT1-GFP). Vi beskriver också användningen av en fluorescerande sur-tropisk sond för att visualisera sura organeller och följa deras människohandel dynamik i levande astrocyter. Slutligen visar vi hur man analyserar tids fördröjnings data för att extrahera och utvärdera transportparametrar för enskilda laster.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en experimentell metod för att uttrycka, visualisera och spåra Fluorescent taggade organeller och membranproteiner av intresse med hjälp av Time-lapse video mikroskopi i hög renhet primära mus kortikala MD astrocyter. Vi beskriver också en metod för att mäta partikel dynamiken. Direkt visualisering av protein och organell dynamik i primära astrocyter ger ett kraftfullt verktyg för att studera regleringen av intracellulär transport i dessa celler in vitro-.
Metoden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DNL fick stöd av University of North Carolina på Chapel Hill (UNC) School of Medicine som Simmons Scholar. TWR stöddes av UNC PREP Grant R25 GM089569. Arbeta med hjälp av UNC Neuroscience Center mikroskopi Core facility stöddes delvis av finansiering från NIH-NINDS neurovetenskap Center support Grant P30 NS045892 och NIH-NICHD intellektuella och utvecklingsstörning Research Center support Grant U54 HD079124.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
- Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
- Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).
- Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
- Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
- Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
- Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
- Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).
- Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
- Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
- . IJ KymoToolBox Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016)
