Istituzione e caratterizzazione degli spheroeroidi del tumore intestinale piccolo intestinale
Summary
I tumori neuroendocrini (NET) provengono da cellule neuroendocrine della cresta neurale. Sono in crescita lenta e impegnativi per la cultura. Vi presentiamo una strategia alternativa per far crescere le piccole viscere cullandoli come sferoidi. Questi sferoidi hanno piccoli marcatori di rete intestinale e possono essere utilizzati per i test antidroga.
Abstract
I tumori neuroendocrini intestinali piccoli (BNCR) sono tumori rari provenienti da cellule enterocrombaffina dell’intestino. La ricerca in questo campo è stata limitata perché sono state generate pochissime linee cellulari SBNET derivate dal paziente. Le cellule SBNET ben differenziate sono a crescita lenta e sono difficili da propagare. Le poche linee cellulari che sono state stabilite non sono prontamente disponibili, e dopo il tempo nella coltura potrebbero non continuare ad esprimere le caratteristiche delle cellule NET. La generazione di nuove linee cellulari potrebbe richiedere molti anni perché le cellule SBNET hanno un lungo tempo di raddoppio e sono necessari molti passaggi di arricchimento per eliminare i fibroblasti associati al cancro. Per superare questi limiti, abbiamo sviluppato un protocollo per la coltura delle cellule SBNET dai tumori rimossi chirurgicamente come sferoidi nella matrice extracellulare (ECM). L’ECM forma una matrice tridimensionale che incapsula le cellule SBNET e imita il microambiente tumorale per consentire alle cellule SBNET di crescere. Qui, abbiamo caratterizzato il tasso di crescita degli sferoidi SBNET e descritto i metodi per identificare i marcatori SBNET usando la microscopia immunofluorescenza e l’immunohistochimica per confermare che gli sferoidi sono cellule tumorali neuroendocrine. Inoltre, abbiamo usato sferoidi SBNET per testare la citotossicità della rapamicina.
Introduction
I tumori neuroendocrini intestinali piccoli (BNCRIT) provengono da cellule enterochromaffine dell’intestino tenue. Anche se gli SBNET sono generalmente noti per crescere lentamente, comunemente metastatizzano al fegato1. Mentre la rimozione chirurgica o l’ablazione del tumore può essere considerata in molti casi, la ricorrenza è quasi universale e, quindi, la terapia medica svolge un ruolo importante nella gestione. Sono stati investiti enormi sforzi per generare nuove linee cellulari SBNET per i test antidroga. Tuttavia, c’è stato molto poco successo. Solo 6 linee di celle SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) sono state segnalate2,3,4,5; e purtroppo una linea cellulare non esprime più i marcatori NET6 e altre tre linee cellulari SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) sono state determinate per essere derivate da linfoblasti trasformati invece di NET7. Al fine di accelerare l’identificazione dei farmaci per il targeting degli SBNET, sono necessari metodi alternativi per il test dei farmaci in vitro.
Qui, sfruttiamo la disponibilità di SBNET resezionati e abbiamo stabilito un modo per coltivare questi SBNET derivati dal paziente come sferoidi in crescita in ECM. L’obiettivo generale di questo manoscritto è quello di descrivere un metodo alla cultura SBNET come una cultura tridimensionale (3D) e delineare le procedure per caratterizzare questi sferoidi per la conservazione dei marcatori SBNET mediante colorazione immunofluorescenza e immunohistochimica.
Inoltre, dimostriamo come questi sferoidi SBNET possono essere utilizzati per testare l’effetto della rapamicina, un farmaco anti-cancro per NET8. La logica alla base di questo protocollo è quello di sviluppare un nuovo metodo per far crescere le cellule SBNET in vitro e usarle per i test antidroga. Il vantaggio di questa tecnica rispetto al metodo tradizionale di stabilire una linea cellulare SBNET è che le colture 3D di SBNETs possono essere rapidamente ottenute e test antidroga possono essere eseguiti entro 3 settimane. Gli sferoidi SBNET potrebbero essere potenzialmente utilizzati come modello per l’esecuzione di schermi di farmaci in vitro per identificare nuovi farmaci per i pazienti SBNET. Poiché le linee cellulari SBNET non sono ampiamente disponibili, le colture 3D degli sferoidi SBNET possono servire come nuovo modello in vitro per studiare gli SBNET e possono essere condivise tra gli scienziati del settore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le colture 3D tumorali sono diventate una risorsa preziosa per i test preclinici sui farmaci15. Varie biobanche organoidi tumorali sono stati recentemente stabiliti da cancro al seno e tumori del cancro alla prostata16,17. In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato alla cultura SBNET come sferoidi e un metodo semplice e veloce per convalidare le colture sferoidi per i marcatori NET mediante immunofluorescenza e testare la sensibi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede P50 CA174521 (a J.R. Howe e A.M. Bellizzi). P.H. Ear ha ricevuto il p50 CA174521 Career Enhancement Program.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
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