İnce Barsak Nöroendokrin Tümör Spheroidlerinin Kurulması ve Karakterizasyonu
Summary
Nöroendokrin tümörler (NeTs) nöral ibik nöroendokrin hücrelerden kaynaklanır. Onlar yavaş büyüyen ve kültüre meydan okuyor. Biz küresel olarak onları culturing tarafından ince bağırsak tan NETs büyümek için alternatif bir strateji salıyoruz. Bu spheroids ince barsak NET belirteçleri var ve ilaç testi için kullanılabilir.
Abstract
İnce barsak nöroendokrin tümörleri (SBNETs) bağırsak enterokromafin hücrelerinden kaynaklanan nadir kanserlerdir. Çok az hasta sbnet hücre hatları üretilmiştir çünkü bu alanda araştırma sınırlı olmuştur. İyi diferansiye SBNET hücreleri yavaş büyür ve yayılması zordur. Kurulan birkaç hücre satırı kolayca kullanılamaz ve kültürde zaman sonra NET hücrelerinin özelliklerini ifade etmeye devam etmeyebilir. SBNET hücrelerinin uzun bir katlama süresine sahip olması ve kanserle ilişkili fibroblastların hızla bölünmesini ortadan kaldırmak için birçok zenginleştirme adımı na ihtiyaç duyulduğundan, yeni hücre hatlarının üretilmesi uzun yıllar sürebilir. Bu sınırlamaları aşmak için, sbnet hücrelerini cerrahi olarak çıkarılan tümörlerden hücre dışı matrikste (ECM) küresel oidler olarak kültüre getirmek için bir protokol geliştirdik. ECM, SBNET hücrelerini kapsülleyen ve SBNET hücrelerinin büyümesine izin verdiği için tümör mikro ortamını taklit eden 3 boyutlu bir matris oluşturur. Burada SBNET spheroidlerinin büyüme hızını karakterize ettik ve sfheroidlerin nöroendokrin tümör hücreleri olduğunu doğrulamak için immünoreskan mikroskobu ve immünohistokimya kullanarak SBNET belirteçlerini tanımlamak için kullanılan yöntemleri tanımladık. Buna ek olarak, rapamisin sitotoksisitesini test etmek için SBNET spheroids kullanılır.
Introduction
İnce barsak nöroendokrin tümörleri (SBNETs) ince bağırsağın enterokromfin hücrelerinden kaynaklanır. SBNETs genellikle yavaş büyümek için bilinen olmasına rağmen, genellikle karaciğer1metastaz . Cerrahi kaldırma veya tümör ablasyon birçok durumda düşünülebilir iken, nüks neredeyse evrensel, ve bu nedenle, tıbbi tedavi yönetiminde önemli bir rol oynar. Uyuşturucu testi için yeni SBNET hücre hatları oluşturmak için muazzam çabalar gösterilmiştir. Ancak, çok az başarı olmuştur. Sadece 6 SBNET hücre hattı (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) bildirilmiştir2,3,4,5; ve ne yazık ki bir hücre hattı artık NET belirteçleri6 ve diğer üç SBNET hücre hatları (KRJ-I, L-STS, H-STS) nets yerine dönüştürülmüş lenfoblastlar türetilmiş olduğu tespit edilmiştir ifade eder7. SBNETs hedeflemeiçin ilaçların belirlenmesini hızlandırmak için, in vitro uyuşturucu testi için alternatif yöntemler gereklidir.
Burada, rezeke edilmiş SBNET’lerin kullanılabilirliğinden yararlanıyoruz ve ecm’de büyüyen spheroidler olarak bu hasta kaynaklı SBNET’leri kültüre almanın bir yolunu oluşturduk. Bu makalenin genel amacı, SBNET’in immünororesans boyama ve immünohistokimya ile SBNET belirteçlerinin tutulması için bu küresel leri karakterize etmek için üç boyutlu (3D) bir kültür ve anahat prosedürleri olarak kültüre yönelik bir yöntemi tanımlamaktır.
Buna ek olarak, bu SBNET spheroids rapamycin etkisini test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek, NETs için bir anti-kanser ilaç8. Bu protokolün arkasındaki mantık, SBNET hücrelerini in vitro olarak büyütmek ve bunları uyuşturucu testi için kullanmak için yeni bir yöntem geliştirmektir. Bu tekniğin geleneksel SBNET hücre hattı oluşturma yöntemine göre avantajı, SBNET’lerin 3Boyutlu kültürlerinin hızla elde edilebiliyor olması ve ilaç testinin 3 hafta içinde yapAbildiğidir. SBNET spheroids potansiyel SBNET hastalar için yeni ilaçlar belirlemek için in vitro ilaç ekranları gerçekleştirmek için bir model olarak kullanılabilir. SBNET hücre hatları yaygın olarak mevcut olmadığından, SBNET spheroids 3D kültürleri SBNETs eğitimi için yeni bir in vitro model olarak hizmet verebilir ve alanında bilim adamları arasında paylaşılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tümör 3D kültürleri preklinik ilaç testi için değerli bir kaynak haline gelmiştir15. Çeşitli tümör organoid biobanks son zamanlarda meme kanseri ve prostat kanseri tümörlerikurulmuştur 16,17. Bu çalışmada, spheroids olarak kültür SBNET için ayrıntılı bir protokol ve immünofloresan ve test ilaç duyarlılığı ile NET belirteçleri için küresel kültürleri doğrulamak için basit ve hızlı bir yöntem sağlar. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH’nin P50 CA174521 (J.R. Howe ve A.M. Bellizzi’ye) verdiği hibelerle desteklenmiştir. P.H. Ear, P50 CA174521 Kariyer Geliştirme Programı ödülüne layık görülmüştür.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines – P-STS, L-STS, H-STS – derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line–letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
