Estabelecimento e caracterização de spheroids do tumor neuroendócrino das entranhas pequenas
Summary
Os tumores neuroendócrinos (NETs) são originários de células neuroendócrinas da crista neural. Eles são lentos crescimento e desafiador para a cultura. Nós apresentamos uma estratégia alternativa para crescer redes das entranhas pequenas cultivando as como spheroids. Estes esferoides têm marcadores líquidos das entranhas pequenas e podem ser usados para o teste de droga.
Abstract
Os tumores neuroendócrinos das entranhas pequenas (SBNETs) são os cancros raros que originam das pilhas enterochromaffin do intestino. A pesquisa neste campo foi limitada porque muito poucas linhas de pilha derivadas paciente do SBNET foram geradas. As células SBNET bem diferenciadas são de crescimento lento e são difíceis de propagar. As poucas linhas celulares que foram estabelecidas não estão prontamente disponíveis, e após o tempo na cultura pode não continuar a expressar características de células NET. A geração de novas linhas celulares pode levar muitos anos desde que as células SBNET têm um longo tempo de duplicação e muitas etapas de enriquecimento são necessárias para eliminar os fibroblastos associados ao câncer em rápida divisão. Para superar estas limitações, nós desenvolvemos um protocolo às pilhas de sbnet da cultura dos tumores cirùrgica removidos como esferoides na matriz extracelular (ECM). O ECM forma uma matriz tridimensional que encapsula as células SBNET e imita o microambiente tumoral para permitir que as células da SBNET cresçam. Aqui, nós caracterizamos a taxa de crescimento de esferoides de sbnet e métodos descritos para identificar marcadores de sbnet usando a microscopia da imunofluorescência e immunohistochemistry para confirmar que os esferoides são pilhas neuroendócrinas do tumor. Além, nós usamos esferoides de sbnet para testar a citotoxicidade do Rapamycin.
Introduction
Os tumores neuroendócrinos das entranhas pequenas (SBNETs) originam das pilhas enterochromaffin do intestino pequeno. Embora os sbnets sejam geralmente conhecidos para crescer lentamente, eles comumente metástase para o fígado1. Quando a remoção cirúrgica ou a ablação do tumor puder ser considerada em muitos casos, o retorno é quase universal, e, conseqüentemente, a terapia médica joga um papel importante na gerência. Esforços enormes foram investidos para gerar novas linhas de células SBNET para o teste de drogas. No entanto, houve muito pouco sucesso. Apenas 6 linhas de células sbnet (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-MS, H-STS) foram relatadas2,3,4,5; e, infelizmente, uma linha celular não expressa mais marcadores NET6 e três outras linhas de células sbnet (KRJ-I, L-STS, H-STS) foram determinadas como derivadas de linfoblastos transformados em vez de redes7. A fim de acelerar a identificação de fármacos para a segmentação da SBNETs, são necessários métodos alternativos para o teste in vitro de fármacos.
Aqui, nós aproveitamos a disponibilidade de sbnets resected e estabelecemos uma maneira de cultivar estes sbnets paciente-derivados como esferoides que crescem no ECM. O objetivo geral deste manuscrito é descrever um método para cultura da SBNET como uma cultura tridimensional (3D) e delinear procedimentos para caracterizar esses esferóides para a retenção de marcadores da SBNET por imunofluorescência e imunohistoquímica.
Além, Nós demonstramos como estes esferoides de sbnet podem ser usados testando o efeito do Rapamycin, uma droga anticancerígena para redes8. A fundamentação subjacente a este protocolo é desenvolver um novo método para cultivar as células da SBNET in vitro e utilizá-las para testes de drogas. A vantagem desta técnica sobre o método tradicional de estabelecer uma linha de pilha de SBNET é que as culturas 3D de SBNETs podem ràpida ser obtidas e o teste de droga pode ser feito dentro de 3 semanas. Os esferoides de sbnet poderiam potencialmente ser usados como um modelo para executar telas in vitro da droga para identificar drogas novas para pacientes de sbnet. Uma vez que as linhas de células SBNET não estão amplamente disponíveis, as culturas 3D de esferóides SBNET podem servir como um novo modelo in vitro para estudar SBNETs e podem ser compartilhadas entre cientistas no campo.
Protocol
Representative Results
Discussion
As culturas do tumor 3D tornaram-se um recurso valioso para o teste de droga pré-clínico15. Os vários e biobancos organoid do tumor foram estabelecidos recentemente dos tumores16,17do cancro da mama e de próstata. Neste estudo, nós fornecemos um protocolo detalhado à cultura sbnet como esferoides e um método simples e rápido para validar as culturas do esferóide para marcadores líquidos pela imunofluorescência e pela sensibilida…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede P50 CA174521 (a J.R. Howe e A.M. Bellizzi). P.H. Ear é um receptor do prêmio P50 CA174521 programa de aprimoramento de carreira.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
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