纤维细胞衍生的三维矩阵系统适用于内皮管形成测定
Summary
此方法的目的是获得成纤维细胞衍生的 3D 基质作为后续细胞测定的天然支架。纤维细胞在预处理培养板中播种，并用抗坏血酸刺激，用于基质生成。基质被去细胞化并阻断以培养相关细胞（例如，内皮细胞）。
Abstract
细胞外基质（ECM）是一种三维支架，作为组织细胞的主要支撑。除了其结构功能外，ECM 还参与细胞迁移、增殖和分化。成纤维细胞是改变ECM光纤排列和生产的主要细胞类型。在癌症中，CAFs（癌症相关成纤维细胞）处于永久活化状态，参与ECM重塑，促进肿瘤细胞迁移，刺激肿瘤相关血管生成，以及其他亲肿瘤作用。此方法的目标是使用永垂成纤维细胞或人类原发性CAF创建一个具有纤维成分类似于体内基质的三维矩阵。纤维细胞在预处理的细胞培养板中培养，并在抗坏血酸刺激下生长。然后，去掉成纤维细胞，并阻止基质进行进一步的细胞播种。在此ECM模型中，可以激活或修改成纤维细胞以生成不同类型的基质，其效应可以在细胞培养中研究。3D矩阵也由细胞信号塑造，如降解或可能改变纤维分布的交联酶。在这种情况下，血管生成可以与其他细胞类型，如上皮肿瘤细胞一起研究。
Introduction
细胞外基质（ECM）是存在于所有类型的组织的动态结构。它由蛋白质和多糖组成，形成对细胞粘附、迁移和通信至关重要的纤维网1。ECM 成分因组织而异。虽然I型胶原蛋白是最常见的结构蛋白，但胶原蛋白类型II、III、V和XI也可在各种组织中发现2。纤维素产生成纤维细胞是细胞粘附2所必需的。此外，还有其他结构分子，如艾氏素，层宁和表面受体称为整体，以调解纤维组装，并特定于不同的ECM组织2。ECM作为细胞支架起着重要的作用，也可以参与生理和病理过程1。在癌症等病理中观察到 ECM 中的异常，从而改变 ECM 组成和/或其组织。在肿瘤中，ECM代表肿瘤微环境（TME）的非细胞成分，这是细胞成分的复杂环境，如成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞、围细胞和各种可溶性因子。众所周知，TME促进癌症进展和转移;癌症相关成纤维细胞，作为肿瘤频段的主要细胞类型，参与这一过程3。与正常的成纤维细胞不同，CAF处于永久活化状态，显示ECM蛋白和生长因子（例如，转化生长因子-β，TGF-β）的分泌增加，以及一些标记物的较高表达，如β-平滑肌活动（β-SMA）和成纤维细胞活化蛋白（FAP）4。然而，CAF是一个异构细胞群，显示不同级别的激活或标记表达式5。可以假定，成纤维细胞衍生基质的组成和结构将取决于成纤维细胞的状态和特性。
在这方面，该方法的目标是通过相当于体内ECM设置的成纤维细胞为ECM生成建立适当的体外模型。我们建议这种方法作为一种体外转化方法，以进一步研究肿瘤细胞功能，如化学抗性或迁移，由ECM调解。正如我们小组在其他地方发表的，CAF可以从新鲜的组织样本中获得，但必须指出，CAF在培养中的生存是有限的，它们的细胞通道数量减少了6。此外，从患者样本建立的CAF主要培养物可用于基质生成。在成纤维细胞中操作基因表达也是产生各种体外基质的有趣方法，以评估对基质组成、纤维方向等的可能影响。沿着这些思路，我们小组最近报告了蜗牛表达成纤维细胞在各种衍生基质7的组成和纤维方向中的作用。
此外，CAFs和ECM也参与血管系统，包括血管生成和花瓶外层8的一部分。ECM重塑诱发血管生成;基质金属蛋白酶（MmPs）似乎是最重要的酶型，有助于这个过程9，10。产生ECM的原细胞的组织血管化、ECM大分子、ECM中残留生长因子、基质弹性和基质厚度被描述为内皮细胞活化11中涉及的因素。在肿瘤中，缺氧增加ECM刚度和内皮芽第12代。此外，CAFs分泌血管内皮生长因子（VEGF）和血小板衍生生长因子（PDGF），刺激肿瘤频闪13的血管生成。在这一领域，体外基质生成可用于研究不同实验条件下的血管生成过程或MMP作用。因此，最相似的体内基质的体外生殖可能是研究ECM在血管生成或微环境细胞相互作用中的作用的宝贵工具。
用抗坏血酸刺激培养成纤维细胞以增强基质沉积并产生ECM是生成类似体基质的公认方法。不朽的成纤维细胞系易于培养，并被不同的生长因子激活，如PDGF-BB、肿瘤坏死因子-β（TNF-α）或TGF-β14。在TME中，CAF合成I型胶原蛋白和纤维蛋白作为ECM4的主要成分。同样，这些成分也被认为是体外产生的成纤维细胞衍生基质的主要成分（图1）。
有不同的体外方法来模拟体内ECM。在过去几年中，使用含有ECM纤维混合物的涂层培养皿得到了扩展，但这种2D方法需要改进3D结构，如交联凝胶（例如，Matrigel）1 。类似母体的设置已成为模拟 3D 矩阵的标准方法。菲布林也是一个替代时，生成矩阵，但失败的强度和耐久性在ECM1。胶原蛋白与其他ECM组件结合使用，弥补了上述一些问题。然而，这些胶原蛋白凝胶形成了一个强大的网络，纤维可以定向，但高度异质性，这可能是一个问题，在实验重复1。然而，必须假定，根据实验的目标，使用Matrigel或其他水凝胶更合适（例如，在易于检测凝胶收缩的基体收缩研究中）。
在一些细胞类型的实验中，生成基质的潜在免疫原性可能是一个问题。因此，为了减少使用我们的方法时ECM生成细胞引起的免疫反应的可能性，对基质进行去细胞化并洗涤，尽管细胞片段去除不能总共15个。理想的ECM需要与细胞培养兼容，能够对细胞信号进行通信和反应。我们的程序允许在ECM生产过程中毫无困难地引入变化（例如，添加成纤维细胞刺激生长因子）。
Protocol
Representative Results
Discussion
基质可以产生不朽的成纤维细胞或初级成纤维细胞培养物。纤维细胞易于在体外培养中保持高生长率和抗应力性。它们甚至可以从死后组织3中分离出来，尽管污染可能是一种限制，这取决于组织的来源。
此处的 3D 矩阵模型为成功研究 ECM 组成和光纤方向提供了一种新颖有效的系统。也可用于分析成纤维细胞活化状态、基因/蛋白质表达、与其他细胞类型的相…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该协议的开发得到了萨卢德·卡洛斯三世研究所的PI12/02037、PI15/02101、PI17/01847、PI18/01034和RD12/0036/0041的支持;由欧洲德萨罗罗地区（FEDER）;由”CIBER de Cáncer”，CB16/12/00273和CB16/12/00446，来自萨卢德·卡洛斯三世-FEDER研究所;由科学基金会AECC（针对胰腺癌的多方面方法）。克里斯蒂娜·佩尼亚是萨卢德·卡洛斯三世研究所米格尔·塞尔维特合同的获得者。欧德先生帮助处理英文课文。我们感谢实验室成员在整个研究中提供帮助和建议。
Materials
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
