Fibroblast-Derived 3D Matrix System anwendbar auf Endothel Tube Formation Assay
Summary
Das Ziel dieser Methode ist es, fibroblast-abgeleitete 3D-Matrizen als natürliches Gerüst für nachfolgende zelluläre Assays zu erhalten. Fibroblasten werden in einer vorbehandelten Kulturplatte gesät und mit Ascorbinsäure für die Matrixgenerierung stimuliert. Matrizen werden dezellularisiert und an kulturrelevante Zellen (z. B. Endothelzellen) blockiert.
Abstract
Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein dreidimensionales Gerüst, das als Hauptstütze für Zellen in Geweben dient. Neben seiner strukturellen Funktion beteiligt sich das ECM auch an zellwanderungs-, Proliferations- und Differenzierungsfunktionen. Fibroblasten sind die Haupttypen von Zellen, die die Anordnung und Produktion von ECM-Fasern verändern. Bei Krebs befinden sich CAFs (krebsassoziierte Fibroblasten) im permanenten Aktivierungsstatus, nehmen an der ECM-Umgestaltung teil, erleichtern die Tumorzellmigration und stimulieren die tumorassoziierte Angiogenese, unter anderem pro-tumorigenic. Das Ziel dieser Methode ist es, eine dreidimensionale Matrix mit einer Faserzusammensetzung zu erstellen, die in vivo Matrizen ähnelt, mit verewigten Fibroblasten oder menschlichen primären CAFs. Fibroblasten werden in vorbehandelten Zellkulturplatten kultiviert und unter Ascorbinsäurestimulation angebaut. Dann werden Fibroblasten entfernt und Matrizen für die weitere Zellaussaat blockiert. In diesem ECM-Modell können Fibroblasten aktiviert oder modifiziert werden, um verschiedene Arten von Matrix zu erzeugen, deren Auswirkungen in der Zellkultur untersucht werden können. 3D-Matrizen werden auch durch Zellsignale geformt, wie Degradation oder Vernetzung von Enzymen, die die Faserverteilung verändern könnten. In diesem Zusammenhang kann die Angiogenese zusammen mit anderen Zelltypen wie epitheliale Tumorzellen untersucht werden.
Introduction
Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist eine dynamische Struktur, die in allen Gewebearten vorhanden ist. Es besteht aus Proteinen und Polysacchariden, die ein Netz von Fasern für Zellhaftung, Migration und Kommunikation1. Die ECM-Zusammensetzung variiert je nach Gewebe. Während Typ-I-Kollagen das am weitesten verbreitete Strukturprotein ist, sind die Kollagentypen II, III, V und XI auch in verschiedenen Geweben zu finden2. Fibronectin, das durch Fibroblasten erzeugt wird, wird für die Zelladhäsion2benötigt. Darüber hinaus gibt es andere strukturelle Moleküle wie Elastin, Laminin und Oberflächenrezeptoren genannt Integrine, die Fasermontage vermitteln und sind spezifisch für die verschiedenen ECM Gewebe2. Das ECM spielt als Zellgerüst eine wichtige Rolle und kann auch an physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt werden1. Anomalien im ECM werden bei Pathologien wie Krebs beobachtet, der die Zusammensetzung und/oder Organisation des ECM verändert. Bei Tumoren stellt das ECM die nichtzelluläre Komponente der Tumormikroumgebung (TME) dar, ein komplexes Milieu von Zellkomponenten wie Fibroblasten, Immunzellen, Endothelzellen, Pericyten und einer Vielzahl von löslichen Faktoren. Es ist bekannt, dass die TME die Krebsprogression und Metastasierung fördert; Krebsassoziierte Fibroblasten, als vorherrschender Zelltyp im Tumor stroma, nehmen an diesem Prozessteil 3. Im Gegensatz zu normalen Fibroblasten befinden sich CAFs in permanenter Aktivierung und zeigen eine erhöhte Sekretion von ECM-Proteinen und Wachstumsfaktoren (z. B. Transforming Growth Factor-, TGF-) sowie eine höhere Expression einiger Marker, wie z. B. “glatter Muskelaktin” (-SMA) und Fibroblasten-Aktivierungsprotein (FAP)4. CAFs sind jedoch eine heterogene Zellpopulation, die unterschiedliche Aktivierungsstufen oder Markerausdruck5anzeigt. Es kann dann davon ausgegangen werden, dass die Zusammensetzung und Struktur von fibroblasten-abgeleiteten Matrizen vom Fibroblastenstatus und den Eigenschaften abhängen.
In diesem Zusammenhang besteht das Ziel dieser Methodik darin, ein geeignetes In-vitro-Modell für die ECM-Erzeugung durch Fibroblasten zu erstellen, das der in vivo ECM-Einstellung entspricht. Wir schlagen diesen Ansatz als in vitro translationale Methodik für weitere Studien von Tumorzellfunktionen wie Chemoresistenz oder Migration vor, die von ECM vermittelt werden. Wie unsere Gruppe an anderer Stelle veröffentlicht hat, können CAFs aus frischen Gewebeproben gewonnen werden, aber es ist zu beachten, dass das Überleben der CAFs in der Kultur begrenzt ist und ihre Zelldurchgangszahl reduziert wird6. Darüber hinaus können CAF-Primärkulturen, die aus Patientenproben hergestellt wurden, für die Matrixgenerierung verwendet werden. Die Manipulation der Genexpression in Fibroblasten ist auch eine interessante Möglichkeit, verschiedene In-vitro-Matrizen zu produzieren, um die möglichen Auswirkungen auf die Matrixzusammensetzung, Faserorientierung usw. zu bewerten. In diesem Sinne hat unsere Gruppe vor kurzem über die Rolle von Schnecken-extierten Fibroblasten in der Zusammensetzung und Faserausrichtung verschiedener abgeleiteter Matrizenberichtet 7.
Darüber hinaus sind CAFs und ECM sowohl bei der Gefäßerzeugung als auch als Teil der Vasenaußenschicht8am Gefäßsystem beteiligt. ECM-Umbau induziert Angiogenese; Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) scheinen der wichtigste Enzymtyp zu sein, der zu diesem Prozess beiträgt9,10. Die Gewebevaskularisation von Primärzellen, die die ECMs, ECM-Makromoleküle, Restwachstumsfaktoren des ECM, Matrixelastizität und Matrixdicke erzeugen, wird als Faktoren beschrieben, die an der Endothelzellaktivierung beteiligt sind11. Bei Tumoren erhöht Hypoxie die ECM-Steifigkeit und die endotheliale Sprossengeneration12. Darüber hinaus sezernieren CAFs vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), die Angiogenese in Tumor stroma13stimulieren. In diesem Bereich könnte die In-vitro-Matrixgenerierung verwendet werden, um Angiogeneseprozesse oder MMP-Wirkung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu untersuchen. Somit könnte die In-vitro-Reproduktion der analogsten In-vivo-Matrix ein wertvolles Werkzeug sein, um die Rolle von ECM bei Angiogenese oder Mikro-Umwelt-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen.
Die Stimulation von kultivierten Fibroblasten mit Ascorbinsäure zur Verbesserung der Matrixabscheidung und zur Erzeugung eines ECM ist eine anerkannte Art, analoge In-vivo-Matrizen herzustellen. Verewigte Fibroblasten-Zelllinien lassen sich leicht kulturalisieren und werden durch verschiedene Wachstumsfaktoren aktiviert, wie PDGF-BB, Tumor-Nekrose-Faktor —-(TNF-) oderTGF-Nr. 14. Innerhalb der TME synthetisieren CAFs Typ-I-Kollagen und Fibronectin als Hauptbestandteile von ECM4. In ähnlicher Weise werden diese Komponenten als Hauptbestandteile von in vitro erzeugten Fibroblasten-abgeleiteten Matrizen gefunden (Abbildung 1).
Es gibt verschiedene In-vitro-Methoden, um in vivo ECM zu simulieren. Die Verwendung von beschichteten Kulturgerichten mit Mischungen von ECM-Fasern wurde in den vergangenen Jahren erweitert, aber dieser 2D-Ansatz musste verbessert werden an 3D-Strukturen, wie z.B. vernetzte Gele (z.B. Matrigel)1. Das Matrigel-ähnliche Setup ist zur Standardmethode zur Simulation einer 3D-Matrix geworden. Fibrin ist auch eine Alternative bei der Erzeugung von Matrizen, scheitert aber in Bezug auf Festigkeit und Haltbarkeit des ECM1. Kollagen, das in Kombination mit anderen ECM-Komponenten verwendet wird, ändert einige der oben genannten Probleme. Diese Kollagengele bilden jedoch ein starkes Netzwerk mit Fasern, die sich orientieren können, aber sehr heterogen sind, was bei Experimentwiederholungen ein Problem sein kann1. Dennoch ist davon auszugehen, dass je nach Ziel der Experimente die Verwendung von Matrigel oder anderen Hydrogelen besser geeignet ist (z. B. in Matrixkontraktionsstudien, in denen die Gelkontraktion leicht nachgewiesen werden kann).
Die potentielle Immunogenität der erzeugten Matrizen könnte ein Problem in Experimenten mit einigen Zelltypen sein. Daher, um die Möglichkeit von Immunantworten aufgrund von ECM-generierenden Zellen zu reduzieren, wenn unsere Methode verwendet wird, werden Matrizen dezellularisiert und gewaschen, obwohl die Entfernung von Zellfragmenten nicht insgesamt15sein könnte. Das ideale ECM muss mit der Zellkultur kompatibel sein und in der Lage sein, zellsignale zu kommunizieren und darauf zu reagieren. Unser Verfahren ermöglicht die problemlose Einführung von Veränderungen während der ECM-Produktion (z. B. Hinzufügen von fibroblastenstimulierenden Wachstumsfaktoren).
Protocol
Representative Results
Discussion
Matrizen können mit verewigten Fibroblasten oder primären Fibroblastenkulturen erzeugt werden. Fibroblasten sind in der In-vitro-Kultur mit einer hohen Wachstumsrate und Stressresistenz leicht zu pflegen. Sie können sogar aus post-mortem Gewebe isoliert werden3, obwohl Kontamination könnte eine Einschränkung sein, je nach Gewebeursprung.
Das 3D-Matrix-Modell bietet hier ein neuartiges und effektives System zur erfolgreichen Untersuchung der ECM-Zusammensetzung und …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Entwicklung dieses Protokolls wurde von PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 und RD12/0036/0041 vom Instituto de Salud Carlos III unterstützt; von der Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); von “CIBER de Céncer”, CB16/12/00273 und CB16/12/00446, vom Instituto de Salud Carlos III-FEDER; und von der Fundacion Cientéfica AECC (ein facettenreicher Ansatz zur Bekämpfung von Bauchspeicheldrüsenkrebs). Cristina Pea ist Empfängerin eines Miguel Servet-Vertrags des Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude half beim englischen Text. Wir danken den Labormitgliedern für die Hilfe und Beratung während dieser gesamten Forschung.
Materials
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
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