Bu yöntemin amacı sonraki hücresel tahliller için doğal bir iskele olarak fibroblast türetilmiş 3D matris elde etmektir. Fibroblastlar önceden işlenmiş bir kültür plakası içinde tohumlanır ve matris üretimi için askorbik asit ile uyarılır. Matrisler hücreden arındırılır ve kültürle ilgili hücrelere (örn. endotel hücreleri) bloke edilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Endotel Tüp Oluşumu Namına Uygulanan Fibroblast Türetilmiş 3D Matris Sistemi
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre dışı matriks (ECM), dokularda hücreler için ana destek görevi gören üç boyutlu bir iskeledir. ECM, yapısal işlevinin yanı sıra hücre göçü, çoğalma ve farklılaşmaya da katılır. Fibroblastlar ECM lif düzenleme ve üretim değiştiren hücrelerin ana türüdür. Kanserde, CAFs (kanser ilişkili fibroblastlar) kalıcı aktivasyon durumu, ECM remodeling katılan, tümör hücre göçü kolaylaştırmak, ve uyarıcı tümör ilişkili anjiyogenez, diğer pro-tümörijenik roller arasında. Bu yöntemin amacı, ölümsüzleştirilmiş fibroblastlar veya insan birincil CAFs kullanarak, in vivo matrisbenzer bir lif bileşimi ile üç boyutlu bir matris oluşturmaktır. Fibroblastlar önceden tedavi edilen hücre kültürü tabakalarında kültürlenir ve askorbik asit stimülasyonu altında yetiştirilir. Daha sonra fibroblastlar çıkarılır ve daha fazla hücre tohumlama için matrisler bloke edilir. Bu ECM modelinde, fibroblastlar etki hücre kültüründe incelenebilir matris, farklı türde oluşturmak için aktive veya değiştirilebilir. 3D matrisler de hücre sinyalleri tarafından şekillenir, bozulma veya lif dağılımını değiştirebilecek çapraz bağlantı enzimleri gibi. Bu bağlamda, anjiyogenez, epitel tümör hücreleri gibi diğer hücre tipleri ile birlikte incelenebilir.
Giriş
Hücre dışı matriks (ECM) tüm doku türlerinde bulunan dinamik bir yapıdır. Hücre yapışması, göç ve iletişim için çok önemli olan liflerin bir ağ oluşturmak proteinler ve polisakkaritler oluşur1. ECM bileşimi dokuya bağlı olarak değişir. Tip-I kollajen en yaygın yapısal protein iken, kollajen türleri II, III, V ve XI de çeşitli dokularda bulunabilir2. Fibroblastlar tarafından üretilen fibronektin hücre adezyonu için gereklidir2. Ayrıca, elastin gibi diğer yapısal moleküller vardır, laminin ve yüzey reseptörleri integrinler denilen bu lif montaj aracılık ve farklı ECM dokulara özgü2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Madrid'deki Ramón y Cajal Hastanesi Araştırma Etik Kurulu'nun onayı ile insan doku örnekleri alındı.
1. Çözümlerin Hazırlanması
- %0.2 jelatin çözeltisi hazırlayın: 500 mL PBS'ye 1 g jelatin ekleyin. Çözeltiyi otomatik olarak tökezle ve 4 °C'de tutun. Kullanmadan önce 0,22 μm filtre ile filtre uygulayın.
- %1 glutaraldehit hazırlayın: 24 mL PBS'ye %25 glutaraldehit stok çözeltisi 1 mL ekleyin. Kullanmadan önce 0,22 μm filtre ile filtre uygulayın.
- 1 M etanolin hazırlayın: Kullanmadan önce steril H2O. Filtre ile etanolamin çözeltisi hazırlayın.
NOT: Etanolamin bir güvenlik kapağı ile sa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
PDGF-BB uyarılmış fibroblastlar daha kalın bir ECM oluşturur. Herrera ve ark. nasıl PDGF uyarılmış fibroblastlar daha kalın bir matris yanı sıra daha yüksek lif oryantasyonu7üretti gösterdi . BJ-hTERT fibroblastları PDGF ile veya PDGF'siz kuluçkaya yatırıldı ve gözlenen temsili alanlar PDGF uyarılmış fibroblast tarafından üretilen matrislerde daha uyumlu hücre dağılımı gösterdi(Şekil 1a). PDGF uyarılmış fibroblastlarda.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Matrisler ölümsüzleştirilmiş fibroblastlar veya primer fibroblast kültürleri ile oluşturulabilir. Fibroblastlar yüksek büyüme hızı ve stres direnci ile in vitro kültürde korumak kolaydır. Hatta post-mortem doku izole edilebilir3, kontaminasyon bir kısıtlama olabilir rağmen, doku kökenine bağlı olarak.
3D-matris modeli burada başarıyla ECM kompozisyon ve lif oryantasyonu çalışma için yeni ve etkili bir sistem sunuyor. Fibroblast aktivasyon durumu, gen/protein ekspresyonu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Teşekkürler
Bu protokolün geliştirilmesi PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 ve RD12/0036/0041 tarafından Instituto de Salud Carlos III tarafından desteklenmiştir; Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) tarafından; tarafından "CIBER de Cáncer", CB16/12/00273 ve CB16/12/00446, Instituto de Salud Carlos III-FEDER tarafından; ve Fundación Científica AECC (pankreas kanseri hedef için çok yönlü bir yaklaşım) tarafından. Cristina Peña, Instituto de Salud Carlos III'ten Miguel Servet Sözleşmesi'ne sahibidir. M. Eaude İngilizce metin ile yardımcı oldu. Biz bu araştırma boyunca yardım ve tavsiye için laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Amonyum hidroksit (NH < alt > 4< / alt >OH) | Roth | A990.1 | |
| Amfoterisin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Sığır Serum Albümini (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endotelyal Bazal Orta (EBM) | Lonza | CC-3121 | kullanmadan önce takviyeler ekleyin |
| Endotel hücreli Bazal Orta Takviyeler (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Etanolamin | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Biowest | S181B-500 | kullanmadan önce ısıyla inaktive edilmiş |
| Fibroblast Büyümesi Bazal Orta (FBM) | Lonza | CC-3131 | kullanmadan |
| önce takviyeleri ekleyinFibroblast Büyüme Ortamı Takviyeleri ve Büyüme Faktörleri (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Sığır derisinden elde edilen jelatin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehit | Sigma | g5882 | |
| L-Askorbik Asit | Sigma | A92902-100G | ışığa duyarlı |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomisin (Kalem/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Rekombinant telomeraz transfekte edilmiş ölümsüzleştirilmiş insan sünnet derisi fibroblastları (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| İnsan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler) | ATCC | PCS-100-013 |
Kaynaklar
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, comp....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
