Endotel Tüp Oluşumu Namına Uygulanan Fibroblast Türetilmiş 3D Matris Sistemi
Summary
Bu yöntemin amacı sonraki hücresel tahliller için doğal bir iskele olarak fibroblast türetilmiş 3D matris elde etmektir. Fibroblastlar önceden işlenmiş bir kültür plakası içinde tohumlanır ve matris üretimi için askorbik asit ile uyarılır. Matrisler hücreden arındırılır ve kültürle ilgili hücrelere (örn. endotel hücreleri) bloke edilir.
Abstract
Hücre dışı matriks (ECM), dokularda hücreler için ana destek görevi gören üç boyutlu bir iskeledir. ECM, yapısal işlevinin yanı sıra hücre göçü, çoğalma ve farklılaşmaya da katılır. Fibroblastlar ECM lif düzenleme ve üretim değiştiren hücrelerin ana türüdür. Kanserde, CAFs (kanser ilişkili fibroblastlar) kalıcı aktivasyon durumu, ECM remodeling katılan, tümör hücre göçü kolaylaştırmak, ve uyarıcı tümör ilişkili anjiyogenez, diğer pro-tümörijenik roller arasında. Bu yöntemin amacı, ölümsüzleştirilmiş fibroblastlar veya insan birincil CAFs kullanarak, in vivo matrisbenzer bir lif bileşimi ile üç boyutlu bir matris oluşturmaktır. Fibroblastlar önceden tedavi edilen hücre kültürü tabakalarında kültürlenir ve askorbik asit stimülasyonu altında yetiştirilir. Daha sonra fibroblastlar çıkarılır ve daha fazla hücre tohumlama için matrisler bloke edilir. Bu ECM modelinde, fibroblastlar etki hücre kültüründe incelenebilir matris, farklı türde oluşturmak için aktive veya değiştirilebilir. 3D matrisler de hücre sinyalleri tarafından şekillenir, bozulma veya lif dağılımını değiştirebilecek çapraz bağlantı enzimleri gibi. Bu bağlamda, anjiyogenez, epitel tümör hücreleri gibi diğer hücre tipleri ile birlikte incelenebilir.
Introduction
Hücre dışı matriks (ECM) tüm doku türlerinde bulunan dinamik bir yapıdır. Hücre yapışması, göç ve iletişim için çok önemli olan liflerin bir ağ oluşturmak proteinler ve polisakkaritler oluşur1. ECM bileşimi dokuya bağlı olarak değişir. Tip-I kollajen en yaygın yapısal protein iken, kollajen türleri II, III, V ve XI de çeşitli dokularda bulunabilir2. Fibroblastlar tarafından üretilen fibronektin hücre adezyonu için gereklidir2. Ayrıca, elastin gibi diğer yapısal moleküller vardır, laminin ve yüzey reseptörleri integrinler denilen bu lif montaj aracılık ve farklı ECM dokulara özgü2. ECM bir hücre iskelesi olarak önemli bir rol oynar ve aynı zamanda fizyolojik ve patolojik süreçler de dahil edilebilir1. ECM’de anormallikler Kanser gibi patolojilerde gözlenir, bu da ECM kompozisyonunu ve/veya organizasyonunu değiştirir. Tümörlerde, ECM tümör mikroçevre (TME), fibroblastlar, bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri, perisitler ve çözünür faktörlerin çeşitli gibi hücre bileşenlerinin karmaşık bir ortam hücresel olmayan bileşeni temsil eder. TME’nin kanser progresyonu ve metastazı teşvik ettiği bilinmektedir; kanserilişkili fibroblastlar, tümör stroma baskın hücre tipi olarak, bu süreçte yer almak3. Normal fibroblastların aksine, CAF’ler kalıcı aktivasyon da, ECM proteinlerinin ve büyüme faktörlerinin (örneğin, Transforming Growth Factor-β, TGF-β) salgılanmasının yanı sıra α-düz kas aktin (α-SMA) ve fibroblast aktivasyon proteini (FAP)4gibi bazı belirteçlerin daha yüksek bir ekspresyonu gösterir. Ancak, CAFs aktivasyon veya marker ifade5farklı düzeylerde gösteren heterojen bir hücre popülasyonu vardır. Daha sonra fibroblast kaynaklı matrislerin bileşimi ve yapısının fibroblast durumuna ve özelliklerine bağlı olacağı varsayılabilir.
Bu bağlamda, bu metodolojinin amacı in vivo ECM ayarına eşdeğer fibroblastlar ile ECM üretimi için uygun bir in vitro model oluşturmaktır. Bu yaklaşımı, ECM aracılığında kemodirenç veya göç gibi tümör hücre fonksiyonlarının daha ileri çalışmaları için in vitro çeviri metodolojisi olarak öneriyoruz. Grubumuz başka bir yerde yayınlandığı gibi, CAFs taze doku örneklerinden elde edilebilir, ancak bu kültürDE CAFs ‘hayatta kalma sınırlı olduğunu ve hücre geçiş sayısıazalır unutulmamalıdır 6. Buna ek olarak, hasta örneklerinden oluşturulan CAF primek kültürleri matris üretimi için kullanılabilir. Fibroblastlarda gen ekspresyonunun manipülasyonu da matris bileşimi, lif oryantasyonu, vb üzerinde olası etkilerini değerlendirmek için çeşitli in vitro matrisler üretmek için ilginç bir yoldur. Bu doğrultuda, grubumuz son zamanlarda çeşitli türemiş matrisler 7 kompozisyon ve lif oryantasyonusal Salyangoz ifadefibroblastlarrolünü bildirdi.
Ayrıca, CAFs ve ECM vasküler sistem, damar üretimi hem de vazo dıştabakasınınbir parçası olarak 8 yer almaktadır. ECM remodeling anjiyogenez indükler; matris metalloproteinazlar (MDP’ ler) bu sürece katkıda bulunan en önemli enzim tipi gibi görünüyor9,10. EcM’leri oluşturan primer hücrelerin doku vaskülarizasyonu, ECM makromolekülleri, ECM’de yer alan artık büyüme faktörleri, matris elastikiyeti ve matris kalınlığı endotel hücre aktivasyonunda rol oynayan faktörler olarak tanımlanır11. Tümörlerde hipoksi ECM sertliğini ve endotel filizi oluşumunu arttırır12. Ayrıca, CAFs salgılar vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) tümör stroma anjiyogenez uyarmak13. Bu alanda, in vitro matris üretimi farklı deneysel koşullar altında anjiyogenez süreçleri veya MMP eylem çalışma için kullanılabilir. Böylece, en analog in vivo matris in vitro üreme anjiyogenez veya mikro-çevresel hücre etkileşimleri ECM rolünü araştırmak için değerli bir araç olabilir.
Matris birikimini artırmak ve Bir ECM oluşturmak için askorbik asit ile kültürlü fibroblastların uyarılması in vivo matrisler benzer üreten kabul edilen bir yoludur. Ölümsüzleştirilmiş fibroblast hücre hatları kolayca kültürlenir ve PDGF-BB, Tümör Nekrozu Faktör-α (TNF-α) veya TGF-β14gibi çeşitli büyüme faktörleri ile aktive edilir. TME içinde, CAFs sentez tip-I kollajen ve fibronektin ECM ana bileşenleri olarak4. Benzer şekilde, bu bileşenler in vitro-oluşturulan fibroblast kaynaklı matrislerin ana bileşenleri olarak bulunur(Şekil 1).
In vivo ECM simüle etmek için farklı in vitro metodolojileri vardır. ECM liflerinin karışımı ile kaplamalı kültür yemeklerinin kullanımı geçmiş yıllarda genişletilmiş, ancak bu 2D yaklaşım çapraz bağlı jeller (örneğin, Matrigel)1gibi 3D yapılar, iyileştirme gerekiyordu. Matrigel benzeri kurulum, 3B matrisi simüle etmek için standart bir yöntem haline gelmiştir. Fibrin de matris üreten bir alternatif ama ECM1gücü ve dayanıklılığı açısından başarısız olur. Kollajen diğer ECM bileşenleri ile birlikte kullanılan yukarıda belirtilen konuların bazılarını değiştirir. Ancak, bu kollajen jeller yönlendirilebilir lifler ilerlikleri ile güçlü bir ağ oluşturmak, ancak son derece heterojen, deney tekrarları bir sorun olabilir1. Bununla birlikte, deneylerin amacına bağlı olarak, Matrigel veya diğer hidrojellerin kullanımının daha uygun olduğu varsayılmalıdır (örneğin, jel kontraksiyonunun kolayca tespit edilebildiği matris daralma çalışmalarında).
Üretilen matrislerin potansiyel immünojenite bazı hücre tipleri ile deneylerde bir sorun olabilir. Bu nedenle, bizim yöntemi kullanırken ECM üreten hücreler nedeniyle bağışıklık yanıtları olasılığını azaltmak için, matrisler hücreden arındırılmış ve yıkanır, hücre parça kaldırma toplam olamazdı rağmen15. İdeal ECM hücre kültürü ile uyumlu olması ve iletişim kurmak ve hücre sinyallerine tepki gerekir. Prosedürümüz, ECM üretimi sırasında (örn. fibroblast uyarıcı büyüme faktörleri ekleyerek) değişikliklerin zorlanmadan başlatılmasını sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Matrisler ölümsüzleştirilmiş fibroblastlar veya primer fibroblast kültürleri ile oluşturulabilir. Fibroblastlar yüksek büyüme hızı ve stres direnci ile in vitro kültürde korumak kolaydır. Hatta post-mortem doku izole edilebilir3, kontaminasyon bir kısıtlama olabilir rağmen, doku kökenine bağlı olarak.
3D-matris modeli burada başarıyla ECM kompozisyon ve lif oryantasyonu çalışma için yeni ve etkili bir sistem sunuyor. Fibroblast aktivasyon dur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu protokolün geliştirilmesi PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 ve RD12/0036/0041 tarafından Instituto de Salud Carlos III tarafından desteklenmiştir; Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) tarafından; tarafından “CIBER de Cáncer”, CB16/12/00273 ve CB16/12/00446, Instituto de Salud Carlos III-FEDER tarafından; ve Fundación Científica AECC (pankreas kanseri hedef için çok yönlü bir yaklaşım) tarafından. Cristina Peña, Instituto de Salud Carlos III’ten Miguel Servet Sözleşmesi’ne sahibidir. M. Eaude İngilizce metin ile yardımcı oldu. Biz bu araştırma boyunca yardım ve tavsiye için laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz.
Materials
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
