מטרת שיטה זו היא להשיג פיברוההדף מטריצות 3D נגזר כפיגום טבעי עבור הבאים הסלולר assays. פיברותקיעות מורצת לוחית התרבות שטופלו מראש ומגורה עם חומצה אסקורבית ליצירת מטריקס. מטריצות מdecellularized וחסומות לתאים רלוונטיים לתרבות (למשל, תאי האנדותל).
מטריצת החילוץ (ECM) היא פיגום תלת מימדי הפועל כתמיכה העיקרית בתאים ברקמות. מלבד תפקידה הקונסטרוקטיבי, ה-ECM משתתפת גם בהעברת תאים, התפשטות ובידול. פיברותקיעות הם הסוג העיקרי של תאים שינוי הסדר סיבים ECM וייצור. בסרטן, CAFs (סרטן הקשורים בגידולים) הם במצב הפעלה קבע, השתתפות שיפוץ ECM, הקלה על הגירה תא הגידול, ומגרה אנגיוגנזה הקשורות לגידול, בין התפקידים הפרו-tuמגניים אחרים. המטרה של שיטה זו היא ליצור מטריצה תלת ממדית עם הרכב סיבים דומה בתוך מטריצות vivo, באמצעות פיברותקיעות מונצח או כף s הראשי האנושי. פיברופיצוצים הם מתורבתים בלוחות מטופלים מראש של תרבות התא, גדל תחת גירוי חומצה אסקורבית. לאחר מכן, פיברותקיעות מוסרים ומטריצות חסומות עבור זריעת תאים נוסף. במודל ECM זה, ניתן להפעיל או לשנות לייצר סוגים שונים של מטריקס, אשר השפעותיו ניתן ללמוד בתרבות התא. מטריצות תלת-ממדית מעוצבות גם על-ידי אותות תאים, כגון אנזימים השפלות או מקושרים, שעשויים לשנות את התפלגות הסיבים. בהקשר זה, ניתן ללמוד אנגיוגנזה, יחד עם סוגי תאים אחרים כגון תאים סרטניים אפיתל.
מטריצת החילוץ (ECM) היא מבנה דינאמי הקיים בכל סוגי הרקמה. הוא מורכב מחלבונים ופוליסכרידים היוצרים רשת של סיבים חיוניים עבור הדבקה, הגירה ותקשורת1. הרכב ECM משתנה בהתאם לרקמה. בעוד סוג-I קולגן הוא חלבון מבניים הנפוצות ביותר, סוגי קולגן II, III, V ו-XI ניתן למצוא גם ברקמות שונות2. Fibronectin שנוצר על ידי פיברותקיעות נדרש עבור הדבקה תא2. יתר על כן, יש מולקולות מבניות אחרות כמו אלסטין, קולטני למינציה ו פני השטח הנקרא אינטגרציה כי בתווך סיבים הרכבה הם ספציפיים רקמות ECM שונים2. ה-ECM ממלאת תפקיד חשוב כפיגום תאים ויכול להיות גם מעורב בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים1. חריגות ב-ECM הם נצפו בפתוגיות כגון סרטן, אשר משנה קומפוזיציה ECM ו/או הארגון שלה. בגידולים, ה-ECM מייצגת את המרכיב הלא-סלולארי של הסביבה המיקרוקומבית (TME), מרכיב סביבתי מורכב של רכיבי תאים כגון פיברותקיעות, תאי החיסון, תאי האנדותל, קרום הלב ומגוון גורמים מסיסים. ידוע כי TME מקדמת התקדמות הסרטן גרורות; סרטן הקשורים פיברותקיעות, כמו סוג תא השולט בסטרומה הגידול, לקחת חלק בתהליך זה3. בניגוד לפיברותקיעות רגילה, cafs נמצאים הפעלה קבועה, מראה הפרשה מוגברת של חלבונים ecm וגורמי גדילה (g., שינוי מקדם הצמיחה-β, tgf-β), כמו גם ביטוי גבוה יותר של כמה סמנים, כגון α-השריר חלקה אקטין (α-SMA)וחלבון ההפעלה פיברוהפיצוץ (fap עם זאת, ה-CAFs הם אוכלוסיית תאים הטרוגנית, המציגה רמות שונות של הפעלה או סימן ביטוי5. ניתן להניח כי אז הרכב והמבנה של מטריצות הנגזר של פיברוהפיצוץ יהיה תלוי במצב ומאפיינים בפיברוהפיצוץ.
בהקשר זה, המטרה של מתודולוגיה זו היא ליצור מודל מתאים ליצירת מבחנה מתאימה לדור ECM באמצעות המקבילה לקביעת vivo ECM. אנו מציעים גישה זו במסגרת מתודולוגיה להפריה חוץ גופית למחקרים נוספים של הפונקציות של תאי הגידול, כמו הגירה או העברה, מתווכת על ידי ECM. כמו הקבוצה שלנו פרסמה במקום אחר, CAFs ניתן להשיג מדגימות רקמה טרייה, אבל יש לציין כי ה-CAFs ‘ הישרדות בתרבות מוגבלת מספר המעבר הסלולרי שלהם מופחת6. בנוסף, התרבויות הראשיות של קפה שהוקמו מדגימות המטופלים ניתן להשתמש עבור יצירת מטריקס. מניפולציה של ביטוי גנים בפיברותקיעות היא גם דרך מעניינת לייצר מגוון מטריצות מבחנה כדי להעריך את ההשפעות האפשריות על הרכב מטריקס, כיוון סיבים, וכו ‘. לאורך הקווים האלה, הקבוצה שלנו דיווחה לאחרונה על התפקיד של חילזון המבטא פיברותקיעות בהרכב וכיוון הסיבים של מטריצות נגזרות שונות7.
יתר על כן, CAFs ו-ECM מעורבים במערכת כלי הדם, הן בדור הספינה והן במסגרת האגרטל החיצוני שכבה8. שיפוץ ECM גורם לאנגיוגנזה; מטריצה מטאלופרוטטיות (mmps) נראה כסוג האנזים החשוב ביותר לתרום לתהליך זה9,10. רקמת הרקמה של התאים הראשוניים היוצרים את ECMs, ECMS קרו, גורמי צמיחה שיורית הכלולים ECMS, אלסטיות מטריקס, ואת עובי מטריצה מתוארים כגורמים מעורבים הפעלת תא אנדותל11. בגידולים, היפוקסיה מגדילה את הנוקשות ECM ואת הדור של נבט האנדותל12. יתר על כן, כף s להפריש כלי דם אנדותל מקדם גידול (בתוספת) וטסיות הנגזר גורם הצמיחה (PDGF) המעוררים אנגיוגנזה בגידול סטרומה13. בתחום זה, ניתן להשתמש ביצירת מטריצות חוץ גופית לחקר תהליכי אנגיוגנזה או פעולת MMP בתנאים ניסיוניים שונים. כך, הרבייה מחוץ לתחום של מטריצה האנלוגית ביותר vivo יכול להיות כלי רב ערך כדי לחקור את תפקידה של ECM באנגיוגנזה או מיקרו-סביבתי אינטראקציות תאים.
גירוי של גידולים מתורבתים עם חומצה אסקורבית כדי לשפר את התצהיר מטריצה וליצור ECM היא דרך מקובלת של הפקת אנלוגית vivo מטריצות. שורות התאים מונצח הפיצוץ בקלות הם מופעלים על ידי גורמי גדילה מגוונים, כמו PDGF-BB, מקדם הגידול נמק-α (TNF-α) או TGF-β14. בתוך TME, כף s סינתזה סוג-I קולגן ו fibronectin כמרכיב העיקרי של ECM4. באופן דומה, מרכיבים אלה מצויים כמרכיבים מרכזיים של מטריצות שנוצרו על-ידי הפריה חוץ גופית (איור 1).
יש שונות במתודולוגיות מבחנה כדי לדמות בvivo ECM. השימוש של מנות תרבות מצופה עם תערובות של סיבים ECM הוארך בשנים האחרונות, אבל זה 2D הגישה הדרושים לשיפור מבנים תלת-ממד, כגון ג’לים מקושרות (g., מטריצות)1. תוכנית ההתקנה מסוג מטריקס הפכה לשיטה הסטנדרטית להדמיית מטריצה תלת-ממדית. פיאין הוא גם חלופה בעת יצירת מטריצות אך נכשלת במונחים של חוזק ועמידות של ECM1. קולגן משמש בשילוב עם רכיבי ECM אחרים לכפר על כמה בעיות הנ ל. עם זאת, אלה ג’ל קולגן טופס רשת חזקה עם סיבים שיכולים להיות מכוונים, אבל הם הטרוגנית מאוד, אשר יכול להיות בעיה בחזרות ניסוי1. עם זאת, יש להניח כי, בהתאם למטרת הניסויים, השימוש במטריצה או בהידרוג אחרים מתאים יותר (למשל, במחקרים של התכווצות מטריקס שבהם ניתן לזהות בקלות את התכווצות ג’ל).
החיסוני הפוטנציאלי של מטריצות שנוצר יכול להיות בעיה בניסויים עם סוגי תאים מסוימים. לכן, כדי להפחית את האפשרות של תגובות החיסון בשל התאים ECM לייצר בעת שימוש בשיטה שלנו, מטריצות הם decellularized ושטף, למרות הסרת קטע התא לא יכול להיות סך15. ECM האידיאלית צריכה להיות תואמת לתרבות התאים ומסוגלת לתקשר ולהגיב לאותות תאים. ההליך שלנו מאפשר הקדמה של שינויים ללא קושי במהלך ייצור ECM (למשל, הוספת פיברוהפיצוץ גורמי צמיחה מעוררים).
מטריצות ניתן לייצר עם פיברופיצוצים מונצח או תרבויות העיקרי פיברוהפיצוץ. פיברותקיעות קל לשמור בתרבות מתורבת עם שיעור צמיחה גבוהה התנגדות מתח. הם יכולים אפילו להיות מבודדים מרקמות שלאחר המוות3, למרות זיהום יכול להיות מגבלה, בהתאם למקור הרקמה.
מודל 3D-מטריקס כאן מ?…
The authors have nothing to disclose.
הפיתוח של פרוטוקול זה נתמך על ידי PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 ו-RD12/0036/0041 מהמכון דה סלרוד קרלוס השלישי; על ידי Fondo אירופo דה Desarrollo אזורית (פדר); על ידי “CIBER de Cáncer”, CB16/12/00273 ו CB16/12/00446, מן המכון דה סלרוד קרלוס השלישי-פדר; ועל ידי הדרך הטובה AECC (גישה רבת-פנים כדי למקד את סרטן הלבלב). כריסטינה פוניה היא מקבל חוזה של מיגל סרוט, ממכון דה סלרוד קרלוס השלישי. מ. Eaude עזר עם הטקסט באנגלית. אנו מודים לחברי המעבדה על עזרה וייעוץ במהלך המחקר.
Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
Triton X100 | Roth | 3051 | |
Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |