Fibroblast-avledet 3D Matrix system som gjelder for endothelial tube formasjon analysen

Summary

Målet med denne metoden er å få Fibroblast-avledet 3D-matriser som et naturlig stillas for påfølgende cellulære analyser. Fibroblaster er sådd i en pre-behandlet kultur plate og stimulert med askorbinsyre for matrise generasjon. Matriser er decellularized og blokkert til kultur relevante celler (f. eks, endothelial celler).

Abstract

Ekstracellulære matrise (ECM) er et tredimensjonalt stillas som fungerer som den viktigste støtten for celler i vev. Foruten sin strukturelle funksjon, deltar ECM også i celle migrasjon, spredning og differensiering. Fibroblaster er den viktigste typen celler modifisere ECM-fiber ordning og produksjon. I kreft, CAFs (kreft assosiert fibroblaster) er i permanent aktiveringsstatus, deltar i ECM remodeling, tilrettelegge tumor celle migrasjon, og stimulere tumor-assosiert angiogenese, blant annet Pro-tumorigene roller. Målet med denne metoden er å skape en tredimensjonal matrise med en fiber sammensetning som ligner in vivo matriser, ved hjelp av udødeliggjort fibroblaster eller menneskelig primære CAFs. Fibroblaster er kultivert i pre-behandlet cellekultur plater og vokst under askorbinsyre stimulering. Deretter blir fibroblaster fjernet og matriser er blokkert for videre celle seeding. I denne ECM-modellen kan fibroblaster aktiveres eller endres for å generere ulike typer matrise, hvis effekter kan bli studert i cellekultur. 3D-matriser er også formet av celle signaler, som degradering eller kryss-linking enzymer som kan endre fiber distribusjon. I denne sammenheng kan angiogenese bli studert, sammen med andre celletyper som epitel tumorceller.

Introduction

Ekstracellulære matrise (ECM) er en dynamisk struktur som finnes i alle typer vev. Den består av proteiner og polysakkarider som skaper et garn av fibre som er avgjørende for vedheft, migrasjon og kommunikasjon¹. ECM sammensetning varierer avhengig av vevet. Mens type-I kollagen er den mest utbredte strukturelle protein, kan kollagen typer II, III, V og XI også finnes i ulike vev². Fibronektin generert av fibroblaster er nødvendig for celle vedheft². Videre er det andre strukturelle molekyler som elastin, laminin og overflate reseptorer kalt integrins som megle fiber montering og er spesifikke for de ulike ECM vev². ECM spiller en viktig rolle som et celle stillas og kan også være involvert i både fysiologiske og patologiske prosesser¹. Unormalt i ECM er observert i patologi som kreft, som endrer ECM sammensetning og/eller dets organisasjon. I svulster representerer ECM den ikke-cellulære komponenten av tumor mikromiljøet (TME), et komplekst miljø av celle komponenter som fibroblaster, immunceller, endothelial celler, pericytes og en rekke løselige faktorer. Det er kjent at TME fremmer kreft progresjon og metastasering; kreft-assosiert fibroblaster, som en dominerende celle type i tumor stroma, ta del i denne prosessen³. I motsetning til normale fibroblaster, CAFs er i permanent aktivering, viser økt sekresjon av ECM proteiner og vekstfaktorer (f. eks, transformere vekstfaktor-β, TGF-β), samt et høyere uttrykk for noen markører, slik som α-glatte muskel utgangen (α-SMA) og Fibroblast aktivisering protein (FAP)⁴. CAFs er imidlertid en heterogen cellepopulasjon, som viser ulike nivåer av aktivering eller markør uttrykk⁵. Det kan antas da at sammensetningen og strukturen av Fibroblast-avledet matriser vil avhenge av Fibroblast status og egenskaper.

I denne sammenhengen er målet med denne metodikken å etablere en hensiktsmessig in vitro-modell for ECM-generering med fibroblaster tilsvarende in vivo ECM-innstilling. Vi foreslår denne tilnærmingen som en in vitro translational metodikk for videre studier av tumor celle funksjoner, som chemoresistance eller migrasjon, formidlet av ECM. Som vår gruppe har publisert andre steder, kan CAFs fås fra ferske vevsprøver, men det må bemerkes at CAFs ‘ overlevelse i kulturen er begrenset og deres celle passasje nummeret er redusert⁶. I tillegg CAF primære kulturer etablert fra pasientens prøver kan brukes for matrise generasjon. Manipulering av genuttrykk i fibroblaster er også en interessant måte å produsere varierte in vitro matriser for å vurdere mulige effekter på matrisen sammensetning, fiber orientering, etc. Langs disse linjene, har vår gruppe nylig rapportert rolle snail-uttrykker fibroblaster i sammensetningen og fiber orientering av ulike avledet matriser⁷.

Videre er CAFs og ECM involvert i det vaskulære systemet, både i fartøy generasjon og som en del av vasen ytre lag⁸. ECM remodeling induserer angiogenese; Matrix metalloproteinases (MMPs) synes å være den viktigste enzymet type bidra til denne prosessen^9,10. Vevs endometrial blodkar til primær celler som genererer ECMs, ECM-makromolekyler, gjenværende vekstfaktorer som er inkludert i ECM, matrise elastisitet og matrise tykkelse er beskrevet som faktorer involvert i endothelial celle aktivering¹¹. I svulster øker hypoksi ECM-stivhet og endothelial generasjon¹². Videre skiller CAFs vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF) og blodplate avledet vekstfaktor (PDGF) som stimulerer angiogenese i tumor stroma¹³. I dette feltet, in vitro Matrix generasjon kan brukes til å studere angiogenese prosesser eller MMP handling under ulike eksperimentelle forhold. Således, in vitro reproduksjon av de mest analoge in vivo matrise kan være et verdifullt verktøy for å undersøke ECM rolle i angiogenese eller mikro-miljømessige celle interaksjoner.

Stimulering av kultivert fibroblaster med askorbinsyre å forbedre matrise avsetning og generere en ECM er en akseptert måte å produsere analoge in vivo matriser. Udødeliggjort Fibroblast cellelinjer er lett kultivert og aktiveres av ulike vekstfaktorer, som PDGF-BB, tumor nekrose faktor-α (TNF-α) eller TGF-β¹⁴. Innenfor TME, CAFs syntetisere type-I kollagen og fibronektin som de viktigste komponentene i ECM⁴. På samme måte er disse komponentene funnet som viktige komponenter av in vitro-generert Fibroblast-avledet matriser (figur 1).

Det finnes forskjellige in vitro-metoder for å simulere in vivo ECM. Bruken av belagte kultur retter med blandinger av ECM-fibre ble utvidet i tidligere år, men denne 2D-tilnærmingen trengte forbedring av 3D-strukturer, slik som tverrbundet gels (f.eks. Matrigel)¹. Matrigel-lignende oppsett har blitt standardmetoden for å simulere en 3D-matrise. Fibrin er også et alternativ når du genererer matriser, men mislykkes i form av styrke og holdbarhet av ECM¹. Kollagen som brukes i kombinasjon med andre ECM-komponenter, endrer noen av ovennevnte problemer. Men disse kollagen gels danne et sterkt nettverk med fibre som kan være orientert, men er svært heterogen, noe som kan være et problem i eksperimentet repetisjoner¹. Likevel må det antas at, avhengig av formålet med eksperimenter, bruk av Matrigel eller andre hydrogeler er mer hensiktsmessig (f. eks i matrisen sammentrekning studier der gel sammentrekning kan lett oppdages).

Den potensielle immunogenisitet av de genererte matriser kan være et problem i eksperimenter med noen celletyper. Derfor, for å redusere muligheten for immunresponser på grunn av ECM-generering celler når du bruker vår metode, matriser er decellularized og vasket, selv om celle fragment fjerning ikke kunne være totalt¹⁵. Den ideelle ECM må være kompatibel med cellekultur og i stand til å kommunisere og reagere på celle signaler. Vår prosedyre gjør det mulig å innføre endringer uten problemer under ECM-produksjon (f.eks. ved å legge til Fibroblast vekstfaktorer).

Protocol

Human vevsprøver ble innhentet med godkjennelse av forskningsetikk styret til sykehuset Ramón y Cajal, Madrid. 1. utarbeidelse av løsninger Forbered 0,2% gelatin løsning: Tilsett 1 g av gelatin til 500 mL av PBS. Autoklav løsningen og hold ved 4 ° c. Filter med et 0,22 μm-filter før bruk. Forbered 1% glutaraldehyde: Tilsett 1 mL 25% glutaraldehyde lagerløsning til 24 mL PBS. Filter med et 0,22 μm-filter før bruk. Forbered 1 M ethanolamine: Forbered etha…

Representative Results

PDGF-BB stimulert fibroblaster skape en tykkere ECM. Herrera et al. viste hvordan PDGF-stimulert fibroblaster genererte en tykkere matrise i tillegg til høyere fiber orientering7. BJ-hTERT fibroblaster ble inkubert med eller uten PDGF og representative områder observert viste en mer justert celle distribusjon i matriser produsert av PDGF-stimulert Fibroblast (figur 1a). Kollagen I og fibronektin protein uttrykk ble ?…

Discussion

Matriser kan genereres med udødeliggjort fibroblaster eller primære Fibroblast kulturer. Fibroblaster er enkle å vedlikeholde i in vitro kultur med høy vekst og stress motstand. De kan også være isolert fra etter obduksjon vev³, selv om forurensning kan være en restriksjon, avhengig av vevet opprinnelse.

3D-Matrix modellen her tilbyr en roman og effektivt system for å kunne studere ECM komposisjon og fiber orientering. Det er også egnet for analyser av Fibrobla…

Materials

Ammonium hydroxide (NH4OH)	Roth	A990.1
Amphotericin-B	Corning	30-003-CF
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906-50G
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning	10-014-CVR
Endothelial Basal Medium (EBM)	Lonza	CC-3121	add supplements before use
Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2)	Lonza	CC-4176
Ethanolamine	Sigma	411000-100ML
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biowest	S181B-500	heat-inactivated before use
Fibroblast Growth Basal Medium (FBM)	Lonza	CC-3131	add supplements before use
Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2)	Lonza	CC-4126
Gelatin from bovine skin	Sigma	G9391-100G
Glutaraldehyde	Sigma	g5882
L-Ascorbic Acid	Sigma	A92902-100G	light sensitive
L-Glutamine	Lonza	BE17-605E
Normocin	Invivogen	3ANT-NR-2
Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CVR
Triton X100	Roth	3051
Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT)	ATCC	ATCC CRL-4001
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	ATCC	PCS-100-013