Sistema a matrice 3D derivato da fibroblasti applicabile al saggio di formazione di tubi endoteliali
Summary
Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere matrici 3D derivate dal fibroblasto come scaffold naturale per i successivi saggi cellulari. I fibroblasti vengono semiizzati in una piastra di coltura pretrattata e stimolati con acido ascorbico per la generazione di matrici. Le matrici vengono decellularizzate e bloccate alle cellule rilevanti di coltura (ad esempio, cellule endoteliali).
Abstract
La matrice extracellulare (ECM) è uno scaffold tridimensionale che funge da supporto principale per le cellule nei tessuti. Oltre alla sua funzione strutturale, l’ECM partecipa anche alla migrazione cellulare, alla proliferazione e alla differenziazione. I fibroblasti sono il principale tipo di cellule che modificano la disposizione e la produzione della fibra ECM. Nel cancro, i CAF (fibroblasti associati al cancro) sono in stato di attivazione permanente, partecipano al rimodellamento eCM, facilitano la migrazione delle cellule tumorali e stimolano l’angiogenesi associata al tumore, tra gli altri ruoli pro-tumorale. L’obiettivo di questo metodo è quello di creare una matrice tridimensionale con una composizione in fibra simile a matrici in vivo, utilizzando fibroblasti immortalati o CAF primari umani. I fibroblasti sono coltivati in placche di coltura cellulare pre-trattate e coltivati sotto stimolazione acida ascorbica. Quindi, i fibroblasti vengono rimossi e le matrici vengono bloccate per un ulteriore seeding cellulare. In questo modello ECM, i fibroblasti possono essere attivati o modificati per generare diversi tipi di matrice, i cui effetti possono essere studiati nella coltura cellulare. Le matrici 3D sono modellate anche da segnali cellulari, come la degradazione o gli enzimi che collegano estrai che potrebbero modificare la distribuzione della fibra. In questo contesto, l’angiogenesi può essere studiata, insieme ad altri tipi di cellule come le cellule tumorali epiteliali.
Introduction
La matrice extracellulare (ECM) è una struttura dinamica presente in tutti i tipi di tessuto. È costituito da proteine e polisaccauri che creano una rete di fibre cruciali per l’adesione cellulare, la migrazione e la comunicazione1. La composizione ECM varia a seconda del tessuto. Mentre il collagene di tipo I è la proteina strutturale più diffusa, i tipi di collagene II, III, V e XI possono anche essere trovati in vari tessuti2. La fibronectina generata dai fibroblasti è necessaria per l’adesione cellulare2. Inoltre, ci sono altre molecole strutturali come l’elastina, laminina e i recettori superficiali chiamati integrins che mediano l’assemblaggio della fibra e sono specifici per i diversi tessuti ECM2. L’ECM svolge un ruolo importante come scaffold cellulare e può anche essere coinvolto in processi fisiologici e patologici1. Le anomalie nell’ECM sono osservate in patologie come il cancro, che altera la composizione ECM e/o la sua organizzazione. Nei tumori, l’ECM rappresenta la componente non cellulare del microambiente tumorale (TME), un complesso ambiente di componenti cellulari come fibrolanti, cellule immunitarie, cellule endoteliali, periciti e una varietà di fattori solubili. È noto che il TME promuove la progressione del cancro e la metastasi; i fibroblasti associati al cancro, come tipo di cellula predominante nello stroma tumorale, prendono parte a questo processo3. A differenza dei fibroblasti normali, i CAF sono in attivazione permanente, mostrando una maggiore secrezione delle proteine ECM e dei fattori di crescita (ad es., Transforming Growth Factor-z, TGF-z), così come un’espressione più alta di alcuni marcatori, come l’actina muscolare s-liscia (z-SMA) e la proteina di attivazionefibroblasta(FAP) 4 . Tuttavia, i CAF sono una popolazione di celle eterogenea che mostra diversi livelli di attivazione o espressione del marcatore5. Si può quindi presumere che la composizione e la struttura delle matrici derivate dal fibroblasto dipenderanno dallo stato e dalle caratteristiche del fibroblasto.
In questo contesto, l’obiettivo di questa metodologia è quello di stabilire un modello in vitro appropriato per la generazione di ECM da fibroblasti equivalenti all’impostazione ECM in vivo. Proponiamo questo approccio come metodologia traslazionale in vitro per ulteriori studi sulle funzioni delle cellule tumorali, come la chemoresistance o la migrazione, mediata da ECM. Come il nostro gruppo ha pubblicato altrove, i CAF possono essere ottenuti da campioni di tessuto freschi, ma va notato che la sopravvivenza dei CAF nella coltura è limitata e il loro numero di passaggio cellulare è ridottodi 6. Inoltre, le colture primarie CAF stabilite dai campioni dei pazienti possono essere utilizzate per la generazione di matrici. La manipolazione dell’espressione genica nei fibroblasti è anche un modo interessante per produrre varie matrici in vitro per valutare i possibili effetti sulla composizione della matrice, sull’orientamento delle fibre, ecc. Lungo queste linee, il nostro gruppo ha recentemente riportato il ruolo dei fibroblasti che esprimono le lumache nella composizione e nell’orientamento della fibra di varie matrici derivate7.
Inoltre, i CAF e gli ECM sono coinvolti nel sistema vascolare, sia nella generazione dei vasi che come parte dello strato esterno del vaso8. Il rimodellamento ECM induce l’angiogenesi; le metalloproteine a matrice (MMP) sembrano essere il tipo di enzima più importante che contribuisce a questo processo9,10. La vascolarizzazione dei tessuti delle cellule primarie che generano le ECM, le macromolecole ECM, i fattori di crescita residui inclusi nell’ECM, l’elasticità della matrice e lo spessore della matrice sono descritti come fattori coinvolti nell’attivazione delle cellule endoteliali11. Nei tumori, l’ipossia aumenta la rigidità ECM e la generazione di germogli endoteliali12. Inoltre, i CAF secernono il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) che stimolano l’angiogenesi nello stroma tumorale13. In questo campo, la generazione di matrici in vitro potrebbe essere utilizzata per studiare i processi di angiogenesi o l’azione MMP in diverse condizioni sperimentali. Pertanto, la riproduzione in vitro della matrice in vivo più analoga potrebbe essere uno strumento prezioso per studiare il ruolo di ECM nell’angiogenesi o nelle interazioni cellulari micro-ambientali.
La stimolazione dei fibroblasti coltivati con acido ascorbico per migliorare la deposizione di matrice e generare un ECM è un modo accettato di produrre matrici analoghe in vivo. Le linee cellulari fibroblaste immortali sono facilmente coltibili e vengono attivate da diversi fattori di crescita, come il PDGF-BB, il Tumor Necrosis Factor-z (TNF-z) o ilTGF-14. All’interno del TME, i CAF sintetizzano il collagene e la fibronectina come componenti principali di ECM4. Analogamente, questi componenti si trovano come componenti principali delle matrici derivate dal fibroblasto generato in vitro (Figura 1).
Ci sono diverse metodologie in vitro per simulare ECM in vivo. L’uso di piatti di coltura rivestiti con miscele di fibre ECM è stato esteso negli anni passati, ma questo approccio 2D ha richiesto un miglioramento delle strutture 3D, come i gel cross-linked (ad esempio, Matrigel)1. L’impostazione simile a Matrigel è diventata il metodo standard per simulare una matrice 3D. Fibrin è anche un’alternativa quando si generano matrici, ma fallisce in termini di resistenza e durata dell’ECM1. Il collagene utilizzato in combinazione con altri componenti ECM modifica alcuni dei problemi di cui sopra. Tuttavia, questi gel di collagene formano una forte rete con fibre che possono essere orientate, ma sono altamente eterogenee, che possono essere un problema nelle ripetizioni degli esperimenti1. Tuttavia, si deve presumere che, a seconda dell’obiettivo degli esperimenti, l’uso di Matrigel o di altri idrogel sia più appropriato (ad esempio, negli studi di contrazione a matrice in cui la contrazione del gel può essere facilmente rilevata).
La potenziale immunogenicità delle matrici generate potrebbe essere un problema negli esperimenti con alcuni tipi di cellule. Pertanto, per ridurre la possibilità di risposte immunitarie dovute alle cellule che generano ECM quando si utilizza il nostro metodo, le matrici vengono decellularizzate e lavate, anche se la rimozione dei frammenti cellulari non poteva essere totale15. L’ECM ideale deve essere compatibile con la coltura cellulare e in grado di comunicare e reagire ai segnali cellulari. La nostra procedura consente l’introduzione di cambiamenti senza difficoltà durante la produzione di ECM (ad esempio, aggiungendo fattori di crescita stimolanti per il fibroblasto).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le matrici possono essere generate con fibroblasti immortalati o colture fibroblaste primarie. I fibroblasti sono facili da mantenere nella cultura in vitro con un alto tasso di crescita e resistenza allo stress. Possono anche essere isolati dal tessuto post-mortem3, anche se la contaminazione potrebbe essere una restrizione, a seconda dell’origine del tessuto.
Il modello a matrice 3D offre un nuovo ed efficace sistema per studiare con successo la composizione ECM e l’o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo sviluppo di questo protocollo è stato supportato da PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 e RD12/0036/0041 dell’Instituto de Salud Carlos III; dalla Fondo europeo de Desarrollo Regional (FEDER); da parte di “CIBER de Càncer”, CB16/12/00273 e CB16/12/00446, dall’Instituto de Salud Carlos III-FEDER; e dal Fundaciàn Cient-fica AECC (un approccio multiforme al cancro al pancreas bersaglio). Cristina Pea è stata insignita di un contratto Miguel Servet dell’Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude ha aiutato con il testo inglese. Ringraziamo i membri del laboratorio per l’aiuto e i consigli durante questa ricerca.
Materials
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
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