Confrontando il modello di carcinoma a cellule renali a celle chiare metastatico stabilito nel rene del topo e sulla membrana coroallantoica del pollo
Summary
Il carcinoma a cellule renali a cellule chiare metastatiche è una malattia senza un modello animale completo per un’indagine preclinica approfondita. Questo protocollo illustra due nuovi modelli animali per la malattia: il modello di topo ortotopicamente impiantato e il modello a membrana corioallantoica del pollo, che dimostrano entrambe metastasi polmonari simili a casi clinici.
Abstract
Il carcinoma a cellule renali a cellule chiare metastatiche (ccRCC) è il sottotipo più comune di cancro renale. CcRCC localizzato ha un esito chirurgico favorevole. Tuttavia, un terzo dei pazienti ccRCC svilupperà metastasi al polmone, che è legato a un esito molto negativo per i pazienti. Sfortunatamente, nessuna terapia è disponibile per questa fase mortale, perché il meccanismo molecolare della metastasi rimane sconosciuto. È noto da 25 anni che la perdita di funzione del gene soppressore del tumore von Hippel-Lindau (VHL) è patognomonica di ccRCC. Tuttavia, non è stato generato alcun modello di topo transgenico clinicamente rilevante di ccRCC. Lo scopo di questo protocollo è quello di introdurre e confrontare due modelli animali di nuova costituzione per il ccRCC metastatico. Il primo è l’impianto renale nel modello murino. Nel nostro laboratorio, il sistema di editing del gene CRISPR è stato utilizzato per eliminare il gene VHL in diverse linee cellulari RCC. L’impianto ortotopico di popolazioni di ccRCC eterogenee nella capsula renale ha creato nuovi modelli di ccRCC che sviluppano robuste metastasi polmonari in topi immunocompetenti. Il secondo modello è il sistema a membrana corioallantoica di pollo (CAM). Rispetto al modello di mouse, questo modello è più tempo, lavoro ed efficiente in termini di costi. Questo modello supportava anche la formazione robusta del tumore e l’intravasation. A causa del breve periodo di 10 giorni di crescita del tumore nella CAM, nessuna metastasi overt è stata osservata dall’immunohistochimica (IHC) nei tessuti embrionali raccolti. Tuttavia, quando la crescita del tumore è stata estesa di due settimane nel pollo tratteggiato, le lesioni micrometastatiche ccRCC sono state osservate dall’IHC nei polmoni. Questi due nuovi modelli preclinici saranno utili per studiare ulteriormente il meccanismo molecolare alla base della metastasi, nonché per stabilire nuovi xenografi (PDX) derivati dal paziente verso lo sviluppo di nuovi trattamenti per il ccRCC metastatico.
Introduction
Il carcinoma a cellule renali (RCC) è il7esimo cancro più comune negli Stati Uniti. Ogni anno, 74.000 americani sono stimati essere di nuova diagnosi, che rappresentano più di 14.000 morti (sottotipo istologico a cellule chiare, o ccRCC, è il sottotipo più comune, che rappresenta circa l’80% dei casi di RCC. I pazienti con malignità localizzata sono trattati con nefrectomia e hanno un tasso di sopravvivenza a 5 anni favorevole del 73%1. Tuttavia, 25%-30% dei pazienti sviluppano metastasi distanti ad organi vitali come i polmoni, con conseguente una scarsa sopravvivenza media di 13 mesi e 5 anni tasso di sopravvivenza di solo 11%1,2,3. È necessaria un’ulteriore comprensione del meccanismo metastatico per migliorare l’esito mortale per il ccRCC metastatico.
La perdita del gene del soppressore del tumore VHL è una lesione genetica distintiva osservata nella maggior parte dei casi umani di ccRCC4,5,6,7. Tuttavia, il meccanismo oncogenico preciso della perdita di VHL nel ccRCC è sconosciuto. Inoltre, lo stato dell’espressione VHL non è predittivo del risultato in ccRCC8. In particolare, nonostante i numerosi tentativi di abbattimento della VHL mirata arene,gli scienziati non sono riusciti a generare anomalie renali oltre le lesioni cistiche preneoplastiche osservate nei topi 9 , anche se combinate con la delezione di altri soppressori tumorali come PTEN e p5310. Questi risultati supportano l’idea che la perdita di VHL da sola è insufficiente per la tumorigenesi o la successiva metastasi spontanea.
Recentemente, il nostro laboratorio ha creato una nuova linea cellulare vHL (VHL-KO) utilizzando CRISPR/Cas9 ha mediato la delezione del gene VHL nella linea cellulare murine VHL ccRCC (RENCA, o VHL-WT)11,12. Abbiamo dimostrato che VHL-KO non è solo mesenchymal, ma promuove anche la transizione epiteliale a mesenchymica (EMT) delle cellule VHL-WT12. EMT è noto per svolgere un ruolo importante nel processo metastatico13. Il nostro lavoro ha inoltre dimostrato che la metastasi polmonare distante si verifica solo con la co-impianto di cellule VHL-KO e VHL-WT nel rene, sostenendo un meccanismo cooperativo di metastasi. È importante sottolineare che il nostro modello VHL-KO e VHL-WT impiantato ortotopicamente porta a robuste metastasi polmonari, ricapitolando i casi clinici di ccRCC. Questo modello di ccRCC metastatico spontaneo compensa la mancanza di un modello murino metastatico transgenico, specialmente nello sviluppo di nuovi farmaci anti-metastasi. Questo protocollo dimostra l’impianto di capsule renali delle popolazioni cellulari eterogenee di cellule RENCA genetiche.
I modelli di pollo CAM hanno una lunga storia nella ricerca per l’angiogenesi e la biologia tumorale a causa dei loro numerosi vantaggi, come riassunto nella Tabella 114,15,16,17,18. In breve, la finestra temporale per la crescita del tumore della CAM è breve, consentendo un massimo di 11 giorni fino a quando il CAM viene distrutto al momento della schiusa del pollo16. Nonostante il breve tempo di crescita, l’apporto nutritivo ricco e lo stato immunodeficiente dell’embrione di pollo consentono un innesto tumorale molto efficiente16,19,20,21. Infine, il costo di ogni uovo fecondato è di 1 dollaro, rispetto a oltre 100 dollari per un topo SCID. Insieme, il modello CAM può servire come un prezioso modello animale alternativo per stabilire nuove PDX con un grande risparmio di tempo e di costi rispetto al mouse. In questo protocollo, abbiamo valutato se il modello era in grado di ricapitolare la biologia del ccRCC metastatico osservato nel modello ortotopico del topo.
| (SCID) Mouse | Cam | Nota | |
| Costo | > 100 dollari ciascuno | 1 DOLLARO ciascuno | Viabilità che vanno dal 50 al 75% |
| Necessità di alloggiamenti per barriere | Sì | No | Riduce ulteriormente i costi e semplifica il monitoraggio seriale dei tumori |
| Tumore direttamente visibile | No | Sì | Figura 3A |
| Tempo per la prima innesto (RENCA) | 2 settimane | 2-4 giorni | rifm 14, 15 |
| Endpoint di crescita (RENCA) | 3-6 settimane | 10 giorni | rifm 14, 15 |
| Metastasi (RENCA) osservata | Sì | Sì nei pulcini | Figura 3D |
| Passaggi seriali | Sì | Sì | ref 16-18 |
| Passaggio ai topi (RENCA) | Sì | Sì | Hu, J., et al. in esame (2019) |
| Mantenere l’eterogeneità tumorale | Sì | Sì | Hu, J., et al. in esame (2019) |
Tabella 1: Vantaggi e limitazioni dei modelli mouse e CAM. Questa tabella confronta i due modelli per i loro vantaggi e limitazioni in termini di tempo richiesto, costo, manodopera, così come la biologia. Il modello CAM ha vantaggi in termini di efficienza, ma ha anche i suoi limiti unici a causa della diversa morfologia tra uccelli e mammiferi. Pertanto, è importante confermare che il modello può mantenere la biologia degli xenografi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per molti pazienti con malignità epiteliale, la metastasi agli organi vitali è la causa primaria della mortalità. Pertanto, è essenziale trovare il meccanismo sottostante e una nuova via di terapia per la malattia metastatica. Purtroppo, mancano modelli animali metastatici ccRCC. La sfida in gran parte è dovuta all’incapacità di ricreare ccRCC nei topi nonostante la generazione di numerosi modelli di topo da knockout VHL mirati a i reni transgenici9,10. Qui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione UCLA JCCC seed, UCLA 3R grant, UCLA CTSI, e UC TRDRP (LW). Ringraziamo il Crump Institute’s Preclinical Imaging Facility, il TPCL e il Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) dell’UCLA per il loro aiuto con metodi sperimentali. La citometria di flusso è stata eseguita nell’UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) e nel Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility, supportato dai premi P30 CA016042 e 5P30 AI028697, e dal JCCC, l’UCLA AIDS Institute, la David Geffen School of Medicine dell’UCLA, l’ufficio del Cancelliere dell’UCLA e l’Ufficio di Ricerca del Vice cancelliere dell’UCLA. La consulenza statistica e i servizi di analisi dei dati sono stati forniti dal programma UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiologia e Research Design (BERD) supportato dal NIH/National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
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