마우스 신장과 닭 융모알란투암 막에 설립된 전이성 맑은 세포 신장 세포 암종 모델 비교
Summary
전이성 맑은 세포 신장 세포 암은 철저한 전임상 조사를 위한 포괄적인 동물 모델이 없는 질병이다. 이 프로토콜은 질병에 대한 두 가지 새로운 동물 모델을 보여줍니다: 정형 이식 마우스 모델과 닭 융모난토막 모델, 둘 다 임상 사례를 닮은 폐 전이를 보여줍니다.
Abstract
전이성 명확한 세포 신장 세포 암 (ccRCC)는 신장암의 일반적인 특수형입니다. 국한 된 ccRCC는 유리한 수술 결과를 가지고 있습니다. 그러나, ccRCC 환자의 1/3은 환자를 위한 아주 나쁜 결과와 관련있는 폐에 전이를 개발할 것입니다. 불행히도, 전이의 분자 기전이 알려지지 않기 때문에 이 치명적인 단계에는 치료법이 없습니다. 폰 히펠-린다우(VHL) 종양 억제 유전자의 기능 상실이 ccRCC의 병리학적인 것으로 25년 동안 알려져 왔다. 그러나, ccRCC의 임상적으로 관련있는 형질전환 마우스 모델은 생성되지 않았다. 이 프로토콜의 목적은 전이성 ccRCC에 대해 새로 설립된 두 개의 동물 모델을 소개하고 비교하는 것입니다. 첫 번째는 마우스 모델의 신장 이식입니다. 우리의 실험실에서, CRISPR 유전자 편집 시스템은 몇몇 RCC 세포주에서 VHL 유전자를 노크하기 위하여 이용되었습니다. 신장 캡슐에 이질적인 ccRCC 인구의 정형외 이식은 면역 적격 마우스에서 강력한 폐 전이를 개발하는 새로운 ccRCC 모델을 만들었습니다. 두 번째 모델은 닭 융모알구막 (CAM) 시스템입니다. 마우스 모델에 비해 이 모델은 더 많은 시간, 노동 및 비용 효율적입니다. 이 모형은 또한 강력한 종양 대형 및 intravasation를 지원했습니다. CAM에서 종양 성장의 짧은 10 일 기간 으로 인해, 수집 된 배아 조직에서 면역 조직 화학 (IHC)에 의해 더 과도한 전이가 관찰되지 않았다. 그러나, 부화된 닭에서 종양 성장이 2주 연장되었을 때, 미세전이성 ccRCC 병변은 폐에서 IHC에 의해 관찰되었다. 이 2개의 새로운 전임상 모형은 전이성 ccRCC를 위한 새로운 처리의 발달을 향해 새로운, 환자 파생된 이종이식 (PDXs)를 확립하기 위하여 전이의 뒤에 분자 기계장치를 추가연구하기 위하여 유용할 것입니다.
Introduction
신장 세포 암 (RCC)는 미국에서 7번째로 가장 흔한 암입니다. 매년, 74,000명의 미국인은 14,000명 이상의 죽음을 차지하는 새로 진단될 것으로 추정됩니다 (명확한 세포 조직학 특수형, 또는 ccRCC는, RCC 케이스의 대략 80%를 차지하는 일반적인 특수형입니다. 국소화 된 악성 종양 환자는 신장 절제술로 치료되며 73 %1의유리한 5 년 생존율을 가지고 있습니다. 그러나, 환자의 25%-30%는 폐와 같은 중요한 기관에 먼 전이를 개발하고, 13 개월의 가난한 평균 생존율과 11 %1,2,3의5 년 생존율을 초래합니다. 전이성 ccRCC에 대한 치명적인 결과를 개선하기 위해서는 전이성 메커니즘에 대한 추가 이해가 필요합니다.
VHL 종양 억제유전자의 손실은 대부분의 인간 ccRCC케이스4, 5,6,7에서관찰되는 특징적인 유전병변이다. 그러나, ccRCC에 있는 VHL 손실의 정확한 oncogenic 기계장치는 불명합니다. 또한 VHL 발현 상태는 ccRCC8에서결과를 예측하지 않습니다. 특히, 신장 상피 표적 VHL 녹아웃에 있는 수많은 시도에도 불구하고, 과학자는 PTEN 과 p5310와같은 그밖 종양 억제제의 삭제와 결합되더라도 마우스9에서관찰된 preneoplastic 낭포성 병변을 넘어 신장 이상을 생성하는 것을 실패했습니다. 이 사실 인정은 혼자 VHL 손실이 종양 발생 또는 후속 자발적인 전이를 위해 불충분하다는 아이디어를 지원합니다.
최근, 우리 연구소는 뮤린 VHL+ ccRCC 세포주(RENCA, 또는 VHL-WT)에서 VHL 유전자의 CRISPR/Cas9 매개 결실을 이용한 새로운 VHL 녹아웃(VHL-KO) 세포주11,12를생성하였다. 우리는 VHL-KO가 중간엽일 뿐만 아니라 VHL-WT세포(12)의중간엽 전이(EMT)에 상피를 촉진한다는 것을 보여주었다. EMT는 전이성프로세스(13)에서중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 우리의 일은 더 멀리 폐 전이는 신장에 있는 VHL-KO 와 VHL-WT 세포의 공동 이식으로만 발생한다는 것을 보여주었습니다, 전이의 협력 기계장치를 지원하. 중요한 것은, 우리의 정형 간 이식 VHL-KO 및 VHL-WT 모델은 강력한 폐 전이를 유도, 임상 ccRCC 케이스를 재입증. 이러한 자발적전이성 전이성 ccRCC 모델은 특히 새로운 항 전이약물의 개발에서 형질전환마우스 모델의 부족을 보상한다. 이 프로토콜은 유전자 조작 RENCA 세포의 이기종 세포 집단의 신장 캡슐 이식을 보여줍니다.
치킨 CAM 모델은표 114, 15,16,17,18에요약된 바와 같이 그들의 수많은 이점으로 인해 혈관신생 및 종양 생물학에 대한 연구에서 오랜 역사를 가지고 있다. 간략하게, CAM 종양 성장을 위한 시간 창은 짧고,닭(16)의부화 시 CAM이 파괴될 때까지 최대 11일을 허용한다. 짧은 성장 시간에도 불구하고, 닭 배아의 풍부한 영양 공급 및 면역 결핍 상태는 매우 효율적인 종양 생착16,19,20,21을가능하게 한다. 마지막으로, 각 수정란의 비용은 SCID 마우스의 경우 $100 이상과 비교하여 ~$1입니다. 함께, CAM 모델은 마우스에 비해 시간과 비용을 크게 절약에 새로운 PDX를 확립에 가치있는 대체 동물 모델역할을 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 모델이 마우스 정형외 모델에서 관찰된 전이성 ccRCC의 생물학을 재현할 수 있었는지 여부를 평가했다.
| (SCID) 마우스 | 캠 | 참고 | |
| 비용 | >$100 각 | ~ $ 1 각 | 50-75%에 이르는 생존율 |
| 배리어 하우징의 필요성 | 예 | 아니요 | 추가 비용 절감 및 종양의 직렬 모니터링 단순화 |
| 직접 보이는 종양 | 아니요 | 예 | 그림 3A |
| 첫 번째 생착에 시간 (RENCA) | 2주일 | 2-4 일 | 참조 14, 15 |
| 성장의 종점 (RENCA) | 3-6주일 | 10일 | 참조 14, 15 |
| 전이 (RENCA) 관찰 | 예 | 예 에 병아리 | 그림 3D |
| 직렬 구절 | 예 | 예 | 참조 16-18 |
| 마우스로 통로 (RENCA) | 예 | 예 | Hu, J., 외. 검토 중 (2019) |
| 종양 이질성 유지 | 예 | 예 | Hu, J., 외. 검토 중 (2019) |
표 1: 마우스 및 CAM 모델의 장점과 제한 사항. 이 표는 필요한 시간, 비용, 노동 및 생물학의 측면에서 장점과 한계에 대한 두 모델을 비교합니다. CAM 모델은 효율성에 장점이 있지만 조류와 포유류 간의 다른 형태로 인해 고유 한 한계가 있습니다. 따라서 모델이 이종이식의 생물학을 유지할 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
상피 악성 종양을 가진 많은 환자를 위해, 중요한 기관에 전이는 사망의 주요 원인입니다. 그러므로, 전이성 질병을 위한 근본적인 기계장치 그리고 치료의 새로운 길을 찾아내기 위하여 필수적입니다. 불행히도, 관련 전이성 ccRCC 동물 모델의 부족이 있다. 큰 부분에서 도전은 수많은 형질전환 신장 상피 표적 VHL 녹아웃 마우스 모델9,10의생성에도 불구?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 UCLA JCCC 종자 교부금, UCLA 3R 교부금, UCLA CTSI 및 UC TRDRP (LW)에 의해 지원되었습니다. 우리는 크럼프 연구소의 전임상 이미징 시설, TPCL 및 UCLA의 실험실 동물 의학부 (DLAM)에게 실험 방법에 대한 도움을 주셔서 감사합니다. 유세포 측정은 UCLA 존슨 종합 암 센터 (JCCC) 및 에이즈 연구 유동 세포 측정 코어 시설에서 수행되었으며, 국립 보건원에서 지원하는 P30 CA016042 및 5P30 AI028697, JCCC, UCLA 에이즈 연구소, UCLA 의과 대학, UCLA 의학부, UCLA 장관 의학과 UCLA 의학부, UCLA 장관 의학부 통계 컨설팅 및 데이터 분석 서비스는 UCLA CTSI 생물 통계학, 역학 및 연구 디자인 (BERD) 프로그램에 의해 제공되었으며, 이는 NIH / 국립 번역 과학 UCLA CTSI 교부금 번호 UL1TR001881에 의해 지원됩니다.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
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