Comparando modelo de carcinoma de célula séuológica metastática clara estabelecida no rim do rato e na membrana chorioallantoico de frango

Summary

Carcinoma de células renais metastáticas claras é uma doença sem um modelo animal abrangente para investigação pré-clínica completa. Este protocolo ilustra dois novos modelos animais para a doença: o modelo de camundongo sutópicamente implantado e o modelo de membrana chorioallantoico de frango, ambos demonstram metástase pulmonar semelhante a casos clínicos.

Abstract

Carcinoma de células renais metastáticas (CCCc) é o subtipo mais comum de câncer renal. CcRCC localizado tem um resultado cirúrgico favorável. No entanto, um terço dos pacientes com CCCc desenvolverá metástases no pulmão, o que está relacionado a um desfecho muito ruim para os pacientes. Infelizmente, nenhuma terapia está disponível para este estágio mortal, porque o mecanismo molecular da metástase permanece desconhecido. Sabe-se há 25 anos que a perda de função do gene supressor de tumor von Hippel-Lindau (VHL) é pathognomonic do CCRCC. No entanto, nenhum modelo de camundongo transgênico clinicamente relevante de CCRCC foi gerado. O objetivo deste protocolo é introduzir e comparar dois modelos animais recém-estabelecidos para ccRCC metastático. A primeira é a implantação renal no modelo do mouse. Em nosso laboratório, o sistema de edição de genes CRISPR foi utilizado para derrubar o gene VHL em várias linhas celulares RCC. A implantação ortotópica de populações heterogêneas de CCRCC para a cápsula renal criou novos modelos ccRCC que desenvolvem metástases pulmonares robustos em camundongos imunocompetentes. O segundo modelo é o sistema de membrana chorioallantoico de frango (CAM). Em comparação com o modelo do mouse, este modelo é mais tempo, mão-de-obra e custo-eficiente. Este modelo também suportava formação e intravasão tumoral robustas. Devido ao curto período de 10 dias de crescimento tumoral em CAM, nenhuma metástase foi observada pela imunohistoquímica (IHC) nos tecidos de embriões coletados. No entanto, quando o crescimento do tumor foi estendido por duas semanas no frango eclodido, as lesões de ccRCC micrometastáticos foram observadas pelo IHC nos pulmões. Esses dois novos modelos pré-clínicos serão úteis para estudar melhor o mecanismo molecular por trás da metástase, bem como para estabelecer novos xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) para o desenvolvimento de novos tratamentos para ccRCC metastático.

Introduction

O carcinoma de células renais (RCC) é o^7º câncer mais comum nos Estados Unidos. Anualmente, estima-se que 74.000 americanos sejam diagnosticados recentemente, representando mais de 14.000 mortes (o subtipo histológico de células claras, ou CCRCC, é o subtipo mais comum, representando aproximadamente 80% dos casos de RCC. Pacientes com malignidade localizada são tratados com nefrectomia e têm uma taxa de sobrevivência favorável de 5 anos de 73%¹. No entanto, 25%-30% dos pacientes desenvolvem metástases distantes para órgãos vitais, como os pulmões, resultando em uma baixa sobrevida média de 13 meses e 5 anos de sobrevivência de apenas 11%^1,2,3. É necessária uma compreensão adicional do mecanismo metastático para melhorar o resultado mortal para ccRCC metastático.

A perda do gene supressor do tumor VHL é uma lesão genética marcante observada na maioria dos casos de CCRCC humano^4,5,6,7. No entanto, o mecanismo oncogênico preciso da perda de VHL no CCRCC é desconhecido. Além disso, o status de expressão VHL não é preditivo do resultado no CCRCC⁸. Notavelmente, apesar de inúmeras tentativas de nocaute de VHL alvo renal-epitelial, os cientistas falharam em gerar anormalidade renal além das lesões císticas pré-neoplásticas observadas em camundongos⁹, mesmo quando combinadas com a exclusão de outros supressores tumorais como PTEN e p53¹⁰. Esses achados apoiam a ideia de que a perda de VHL por si só é insuficiente para tumorigênese ou a metástase espontânea subsequente.

Recentemente, nosso laboratório criou uma nova linha de células VHL knockout (VHL-KO) usando a exclusão mediada CRISPR/Cas9 do gene VHL na linha de células murine VHL+ ccRCC (RENCA, ou VHL-WT)^11,12. Mostramos que vhl-ko não é apenas mesenquimal, mas também promove transição epitelial para mesonquimal (EMT) das células VHL-WT¹². A EMT é conhecida por desempenhar um papel importante no processo metastático¹³. Nosso trabalho mostrou ainda que a metástase pulmonar distante ocorre apenas com a co-implantação de células VHL-KO e VHL-WT no rim, apoiando um mecanismo cooperativo de metástase. É importante ressaltar que nosso modelo VHL-KO e VHL-WT implantados ortotópicos leva a metástases pulmonares robustas, recapitulando os casos clínicos de CCRCC. Este modelo ccRCC metastático espontâneo compensa a falta de um modelo de camundongo metastático transgênico, especialmente no desenvolvimento de novas drogas antimetástas. Este protocolo demonstra a implantação da cápsula renal das populações de células heterogêneas de células RENCA geneticadas.

Os modelos chicken CAM têm uma longa história em pesquisa para angiogênese e biologia tumoral devido às suas inúmeras vantagens, conforme resumido na Tabela^{114,15,16,17,18}. Resumidamente, a janela de tempo para o crescimento do tumor CAM é curta, permitindo um máximo de 11 dias até que a CAM seja destruída após a eclosão do frango¹⁶. Apesar do curto tempo de crescimento, o rico fornecimento de nutrição e o estado imunodeficiente do embrião de frango permitem enenxerto tumoral muito eficiente^16,19,20,21. Finalmente, o custo de cada óvulo fertilizado é de ~$1, em comparação com mais de US $ 100 para um mouse SCID. Juntos, o modelo CAM pode servir como um valioso modelo animal alternativo na criação de novos PDXs a uma grande economia no tempo e custo em comparação com o mouse. Neste protocolo, avaliamos se o modelo foi capaz de recapitular a biologia do ccRCC metastático observado no modelo ortotópico do camundongo.

	(SCID) Mouse	Cam	Nota
Custo	>$100 cada	~$1 cada	Viabilidade variando de 50 a 75%
Necessidade de moradia de barreiras	Sim	Não	Reduz ainda o custo e simplifica o monitoramento em série dos tumores
Tumor diretamente visível	Não	Sim	Figura 3A
Hora do primeiro enenxerto (RENCA)	2 semanas	2-4 dias	árbitro 14, 15
Ponto final do crescimento (RENCA)	3-6 semanas	10 dias	árbitro 14, 15
Metástase (RENCA) observada	Sim	Sim, em pintinhos.	Figura 3D
Passagens em série	Sim	Sim	ref 16-18
Passagem para ratos (RENCA)	Sim	Sim	Hu, J., et al. revisão (2019)
Manter a heterogeneidade tumoral	Sim	Sim	Hu, J., et al. revisão (2019)

Tabela 1: Vantagens e limitações dos modelos mouse e CAM. Esta tabela compara os dois modelos por suas vantagens e limitações em termos de tempo, custo, mão-de-obra, bem como a biologia. O modelo CAM tem vantagens em eficiência, mas também tem suas próprias limitações únicas devido à diferente morfologia entre aves e mamíferos. Por isso, é importante confirmar que o modelo pode reter a biologia dos xenoenxertos.

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), designado como Comitê de Pesquisa Animal (ARC) (ARC 2002-049-53 e ARC 2017-102-01A). O protocolo 2002-049-53 é otimizado para a implantação de células tumorais ccRCC na cápsula renal de camundongos Nus ou BALB/c. Experimentos de implantação de tumores em ovos de frango fertilizados antes da eclosão não exigem aprovação do IACUC. Para estender o tempo para o estabelecimento da metástase pulmonar, …

Representative Results

Cada experimento foi realizado pelo menos 3x, a menos que seja declarado de outra forma. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). O significado foi determinado por um teste T do aluno quando havia dois grupos ou por uma ANOVA unidirecional quando havia três ou mais grupos. Um corte de valor P de 0,05 foi usado para estabelecer significado. As células RENCA implantadas com ortotópico cresceram com sucesso…

Discussion

Para muitos pacientes com malignidades epiteliais, a metástase a órgãos vitais é a principal causa de mortalidade. Portanto, é essencial encontrar o mecanismo subjacente e uma nova via de terapia para doenças metastáticas. Infelizmente, há falta de modelos animais ccRCC metastáticos relevantes. O desafio em grande parte deve-se à incapacidade de recriar ccRCC em camundongos, apesar da geração de numerosos modelos de mouse nocaute VHL alvo transgênicos^9,10<…

Materials

0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18
anti-VHL antibody	Abcam	ab135576
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	BD Biosciences	14-826-79
BD Pharm Lyse	BD Biosciences	555899
BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826-5D
DAB Chromogen Kit	Biocare Medical	DB801R
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
DPBS without Calcium and Magnesium	Gibco	LS14190250
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)	eBioscience	14-6681-82
Ethanol 200 Proof	Cylinders Management	43196-11	Prepare 70% in water
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions	Fisher Scientific	10-437-028
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-940
Fisherbrand Sterile Cotton Balls	Fisher Scientific	22-456-885
FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129
Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology	MilliporeSigma	1.00496.5000
Hamilton customized syringe	Hamilton	80408	25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm
HA-probe Antibody (Y-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc805
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D
Isothesia (Isoflurane) solution	Henry Schein Animal Health	1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel GFR Membrane Matrix	Corning	C354230
Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18"	Medex Supply	MED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation	MilliporeSigma	2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin	Fisher Scientific	MT-30-002-CI
Pentobarbital Sodium	Sigma Aldrich	57-33-0	Prepare 1% in saline
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use	Ricca Chemical	395516
pSicoR	Addgene	11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC227420500
Renca	ATCC	CRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine	Corning	10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile	Fisher Scientific	AB-0700
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96)	Thomas Scientific	1159M40
Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls	Office Depot	220717
Suture	Ethicon	J385H
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	1634
Thermo-Chicken Heated Pad	K&H manufacturing	1000
Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017
VHL-KO			CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase
VHL-WT			Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR	Fisher Scientific	50-822-331
Wound autoclips kit	Braintree scientific, inc.	ACS KIT
Xylenes (Histological), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X3S-4