लगातार प्रवाह में प्राथमिक मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं के न्यूमोकॉकस संक्रमण
Summary
इस अध्ययन में परिभाषित प्रवाह स्थितियों में कतरनी तनाव के तहत विभेदित मानव प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की सतह पर उत्पादित वॉन Willebrand कारक तार के लिए न्यूमोकॉकस पालन की सूक्ष्म निगरानी का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल विशिष्ट सेल संरचनाओं की विस्तृत दृश्य और अंतर इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रियाओं को लागू करने से बैक्टीरिया के परिमाणीकरण के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
एंडोथेलियल कोशिकाओं की सतह के साथ स्ट्रेप्टोकॉकस न्यूमोनिया की बातचीत को वॉन विलेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ) जैसे मेकेनोसेंसिटिव प्रोटीन के माध्यम से रक्त प्रवाह में मध्यस्थता की जाती है। यह ग्लाइकोप्रोटीन कतरनी तनाव के जवाब में अपनी आणविक रचना को बदलता है, जिससे मेजबान-लिगंड अन्योन्यक्रियाओं के व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए बाध्यकारी स्थलों को उजागर किया जाता है। सामान्य में, एक परिभाषित कतरनी प्रवाह के तहत प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की culturing विशिष्ट सेलुलर भेदभाव और एक स्थिर और कसकर जुड़े endothelial परत के गठन को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है एक रक्त वाहिका के भीतर की परत के शरीर क्रिया विज्ञान के समान . इस प्रकार, जीवाणु रोगजनकों और मैनेनोसेन्सेटिव प्रोटीन को शामिल मेजबान vascualature के बीच बातचीत के कार्यात्मक विश्लेषण पंप सिस्टम है कि शारीरिक प्रवाह बलों की सतह को प्रभावित करने के लिए जाना जाता अनुकरण कर सकते हैं की स्थापना की आवश्यकता है संवहनी कोशिकाओं.
इस अध्ययन में प्रयुक्त माइक्रोफ्लूइडिक उपकरण एक परिभाषित प्रवाह दर के साथ तरल पदार्थ के एक सतत और नाड़ीहीन पुनर्संचरण में सक्षम बनाता है। कंप्यूटर नियंत्रित हवा दबाव पंप प्रणाली एक सतत, undirectional, और नियंत्रित मध्यम प्रवाह पैदा करके endothelial सेल सतहों पर एक परिभाषित कतरनी तनाव लागू होता है. कोशिकाओं और जीवाणु लगाव के Morphological परिवर्तन सूक्ष्म दृष्टि से निगरानी की जा सकती है और विशेष चैनल स्लाइड है कि सूक्ष्म दृश्य के लिए डिजाइन किए हैं का उपयोग करके प्रवाह में मात्रा निर्धारित. स्थिर सेल संस्कृति संक्रमण के विपरीत, जो सामान्य रूप में प्रतिरक्षा लेबलिंग और सूक्ष्म विश्लेषण से पहले एक नमूना निर्धारण की आवश्यकता है, microfluidic स्लाइड प्रोटीन, बैक्टीरिया, और सेलुलर घटकों के फ्लोरोसेंट आधारित पता लगाने दोनों सक्षम नमूना निर्धारण के बाद; सीरियल इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला; और वास्तविक समय में प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट आधारित पता लगाने। फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया और विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के साथ संयोजन में, इस संक्रमण प्रक्रिया संवहनी प्रक्रियाओं से संबंधित वैज्ञानिक अनुप्रयोगों का एक बड़ा स्पेक्ट्रम के लिए एक कुशल एकाधिक घटक दृश्य प्रणाली प्रदान करता है।
Introduction
न्यूमोकॉकस संक्रमण के रोगजनन को अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स यौगिकों की विविधता और मानव हेमोटासिस के घटकों के साथ बहुमुखी बातचीत की विशेषता है, जैसे प्लाज्मिनोजेन और वीडब्ल्यूएफ1,2, 3,4,5,6,7,8. बहुडोमेन ग्लाइकोप्रोटीन वीडब्ल्यूएफ संवहनी थ्रोम्बस गठन9के स्थल पर थ्रोम्बोसाइट भर्ती और फाइब्रिन निगमन को मध्यस्थता करके संतुलित हेमेस्टासिस के प्रमुख नियामक के रूप में कार्य करता है . कार्यात्मक के महत्व, खून बह रहा नियंत्रण और घाव भरने के लिए सक्रिय VWF वॉन Willebrand रोग, एक आम विरासत में मिला खून बह रहा विकार10द्वारा प्रदर्शन किया है.
ग्लोबुलर वीडब्ल्यूएफ मानव रक्त प्रणाली में 14.0 ग्राम/एमएल11,10तक की सांद्रता में परिकलित करता है . संवहनी चोट के जवाब में, endothelial Weibel Palade निकायों (WBP) द्वारा VWF के स्थानीय रिलीज उल्लेखनीय रूप से11,12वृद्धि हुई है. पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि मानव endothelial कोशिकाओं के लिए न्यूमोकॉकस पालन और छिद्र बनाने विष न्यूमोलिसिन के अपने उत्पादन काफी luminal VWF स्राव को उत्तेजित करताहै 13. रक्त प्रवाह के हाइड्रोडायनामिक बलों mechanoresponsive VWF डोमेन के एक संरचनात्मक खोलने के लिए प्रेरित. 10 डाइन/सेमी2 की प्रवाह दरों पर वीडब्ल्यूएफ कई सौ माइक्रोमीटर तक के लंबे प्रोटीन तारों को बहुमद करता है जो सबएंडोथेलियम10,12से जुड़ा रहता है .
एंडोथेलियल सतह के साथ न्यूमोकॉकस की बातचीत में कतरनी तनाव के तहत उत्पन्न multimerized VWF तार के समारोह को समझने के लिए, एक microfluidic आधारित सेल संस्कृति संक्रमण दृष्टिकोण स्थापित किया गया था। एक सॉफ्टवेयर नियंत्रित हवा दबाव पंप प्रणाली के साथ एक microfluidic डिवाइस का इस्तेमाल किया गया था. यह एक परिभाषित प्रवाह दर के साथ सेल संस्कृति माध्यम के एक सतत, undirectional पुनर्संचरण सक्षम. इस प्रकार, प्रणाली endothelial कोशिकाओं की सतह पर एक परिभाषित कतरनी तनाव लागू है, जो विशेष चैनल स्लाइड के अंदर संलग्न रहे. इस दृष्टिकोण मानव संवहनी प्रणाली के रक्त प्रवाह के भीतर कतरनी बल के अनुकरण सक्षम है, जिसमें VWF तार परिभाषित निरंतर प्रवाह की स्थिति के तहत विभेदित endothelial कोशिकाओं पर उत्पन्न कर रहे हैं. इस उद्देश्य के लिए, endothelial कोशिकाओं विशिष्ट चैनल स्लाइड में खेती की गई (सामग्री की तालिकादेखें), जो प्रवाह के दौरान सूक्ष्म विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया. microfluidic पंप प्रणाली अत्यधिक परिभाषित और नियंत्रित कतरनी तनाव confluent endothelial सेल परत पर विस्तारित VWF तार के गठन के लिए आवश्यक स्थिति प्रदान की. हिस्टामाइन पूरकता द्वारा confluently विकसित मानव नाभि नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) के VWF-स्राव की उत्तेजना के बाद, स्ट्रिंग गठन एक कतरनी तनाव लागू करने से प्रेरित किया गया था (जेड) 10 dyn/ अपरूपण प्रतिबल को कोशिका परत पर कार्य करने वाले बल के रूप में परिभाषित किया जाता है। यह लगभग कॉर्निश एट के अनुसार गणना की है. अल.14 समीकरण 1 के साथ:
जहाँ र्ं र्ं र्ंर्ं र्ं र्ं र्ं र्ंर्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र् र्
समीकरण 1 का परिणाम उपयोग की जाने वाली विभिन्न स्लाइडों की विभिन्न ऊँचाइयों और चौड़ाई पर निर्भर करता है (सामग्री की सारणीदेखें ) इस अध्ययन में 131.6 के एक कक्ष स्लाइड कारक में जिसके परिणामस्वरूप 0.4 डिग्री उ की एक Luer चैनल स्लाइड का उपयोग किया गया था (सूत्र 2 देखें).
37 डिग्री सेल्सियस पर माध्यम की विशालता 0ण्0072 डाइन्स/सेमी2 है और 10 डाइन/सेमी2 के एक कतरनी तनाव का उपयोग किया गया था। इसके परिणामस्वरूप 10.5 एमएल/मिनट की प्रवाह दर हुई (सूत्र 3 देखें)।
यहाँ, जांच और मेजबान vasculature में जीवाणु संक्रमण तंत्र के दृश्य के लिए एक undirectional स्तरीय प्रवाह प्रणाली का उपयोग कर एक microfluidic सेल culturing प्रक्रिया के अनुकूलन और प्रगति विस्तार से वर्णित है. एंडोथेलियल परतों पर वीडब्ल्यूएफ तारों की पीढ़ी को अन्य पंप प्रणालियों का उपयोग करके भी प्रेरित किया जा सकता है जो सतत और स्थिर कतरनी तनाव15लागू करने में सक्षम हैं ।
VWF स्ट्रिंग गठन के प्रवाह और उत्तेजना में संगम के लिए प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की खेती के बाद, न्यूमोकोसी लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त (आरएफपी)16 लगातार सूक्ष्म नियंत्रण के तहत endothelial सेल परत में जोड़ा गया. एंडोथेलियल कोशिकाओं की सतह पर VWF तार करने के लिए बैक्टीरिया के लगाव सूक्ष्म रूप से कल्पना की थी और VWF विशेष फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी का उपयोग करके वास्तविक समय में तीन घंटे के लिए निगरानी की. इस दृष्टिकोण के साथ, एक आसंजन सहकारक के रूप में VWF की भूमिका संवहनी endothelium के लिए जीवाणु लगाव को बढ़ावा देने8निर्धारित किया गया था.
प्रोटीन स्राव और अनुरूपता परिवर्तन के सूक्ष्म दृश्य के अलावा, इस विधि का उपयोग वास्तविक समय में जीवाणु संक्रमण प्रक्रियाओं के एकल चरणों की निगरानी करने और विभिन्न समय बिंदुओं पर संलग्न बैक्टीरिया की मात्रा को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है संक्रमण. विशिष्ट सॉफ्टवेयर नियंत्रित पंप प्रणाली भी कई दिनों के लिए परिभाषित निरंतर प्रवाह की स्थिति में endothelial कोशिकाओं संस्कृति के लिए संभावना प्रदान करता है और एक परिभाषित स्पंदित मध्यम प्रवाह ऊष्मायन सक्षम बनाता है. इसके अलावा, इस विधि विभिन्न प्रकार के सेल का उपयोग कर लागू किया जा सकता है. दाग प्रोटोकॉल अनुकूलन भी पता लगाने और यूकैरियोटिक कोशिकाओं में internalized बैक्टीरिया के दृश्य में सक्षम बनाता है.
इस पांडुलिपि इस उन्नत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है कि pathophysiological प्रक्रियाओं के एक कुशल और बहुमुखी विशेषता के लिए एक परिभाषित, विश्वसनीय, और पुन: उत्पादनीय दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऐसे VWF के रूप में mechanosensitive मेजबान प्रोटीन के साथ जीवाणु संपर्क के अनुकरण एक perfusable सेल संस्कृति प्रणाली है कि एक परिभाषित, undirectional, और तरल पदार्थ की निरंतर प्रवाह की पीढ़ी सक्षम बनाता है की आवश्यकता है, जिससे विश?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को डीएफजी (बीई 4570/
Materials
| 1 mL Luer-syringe | Fisher Scientific | 10303002 | with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides |
| 2 mL Luer-syringe | Sarstedt | 9077136 | For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides |
| Accutase | eBioscience now thermo fisher | 00-4555-56 | protease mix used for gentle detachment of endothelial cells |
| AlexaFluor350-conjugated Phalloidin | Abcam | ab176751 | no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µl of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings) |
| AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody | Thermo Fisher Sientific | A11001 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence |
| AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | complex bacterial culture medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilized, for preparation of blocking buffer |
| Cell culture flasks with filter | TPP | 90026 | subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface |
| Centrifuge Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | spinning down of bacteria (volumes of > 2mL) |
| Centrifuge Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | spinning down of eukaryotic cells |
| Centrifuge Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 – Z 216 M | spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL) |
| Chloramphenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette |
| Clamp for perfusion tubing | ibidi | 10821 | for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system |
| CO2-Incubator | Fisher Scientific | MIDI 40 | incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37°C and 5% CO2 |
| CO2-Incubator | Sanyo | MCO-18 AIC | for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37°C |
| Colombia blood agar plates | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood |
| Computer | Dell | Latitude 3440 | Comuter with pressure pump software |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Leica | DMi8 | An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel) |
| Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | used for PBS buffer |
| Drying material | Merck | 101969 | orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor |
| ECGM supplement Mix | Promocell | C-39215 | supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 µg / mL heparin, 1 µg / mL Hydrocortisone |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion |
| Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) | Promocell | C-22010 | culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix |
| Fetal Calf Serum (FCS) | biochrome now Merck | S 0415 | supplement for cell culture, used for infection analyses |
| FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody | Abcam | ab8822 | stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow |
| Fluidic Unit | ibidi | 10903 | fluidic unit for flow cultivation |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | for precoating of microslide channel surface |
| histamine dihydrochloride | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen |
| Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc73268 | stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation |
| Injection Port | ibidi | 10820 | for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation |
| Light microscope | Zeiss | Axiovert 35M | inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface. |
| Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) | Sigma Aldrich | M7506-500G | For preparation of ECGMS medium |
| Microfluidic Pump | ibidi | 10905 | air pressure pump |
| Neubauer cell counting chamber | Karl Hecht GmbH&Co KG | 40442002 | microscopic counting chamber for HUVECs |
| Paraformaldehyde 16% (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | for cross linking of samples |
| Perfusion Set | ibidi | 10964 | Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37°C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4 | ||
| Plastic cuvettes | Sarstedt | 67,741 | (2 x optic) for OD measurement at 600 nm |
| Pneumococcus-specific antiserum | Pineda | raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column. | |
| Polystyrene or Styrofoam plate | this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2. | ||
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | used for PBS buffer |
| Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow |
| reaction tubes 1.5/ 2.0mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | required for antibody dilutions |
| reaction tubes with 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| RFP-expressing pneumococci | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome |
| serological pipets 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | for pipeting larger volumes |
| Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) | Sigma Aldrich | 451614-25G | for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | used for PBS buffer |
| Spectral Photometer Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | for preparation of blocking buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation |
| Yeast extract | oxoid | LP0021 | bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY |
References
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
- Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
- Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
- Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
- Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
- Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
- Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
- Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).
- Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
- Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
- Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
- Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
- Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
- Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
- Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
- Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
- Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
- Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
- Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
- Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
- Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
- Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
- Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
- Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
- Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
- Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , (2005).
- Shaw, J. A., Shaw, A. J. . Epithelial cell culture- a practical approach. , 218 (1996).
- Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
- Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
- Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).
