Pneumokocker infektion av primära humana endotelceller i konstant flöde

Summary

Denna studie beskriver den mikroskopiska övervakningen av pneumokocker anslutning till von Willebrands faktor strängar som produceras på ytan av differentierade mänskliga primära endotelceller under skjuvning stress i definierade flödesförhållanden. Detta protokoll kan utökas till detaljerad visualisering av specifika cellstrukturer och kvantifiering av bakterier genom att tillämpa differentiell immunofärgning procedurer.

Abstract

Interaktion av Streptococcus pneumoniae med ytan av endotelceller förmedlas i blodflödet via mechanosensitive proteiner såsom von Willebrands faktorn (VWF). Detta glykoprotein förändrar dess molekylära konformation som svar på skjuvning stress, därigenom exponera bindningsställen för ett brett spektrum av värd-ligand interaktioner. I allmänhet är odling av primära endotelceller under ett definierat skjuvflöde känt för att främja den specifika cellulära differentieringen och bildandet av ett stabilt och tätt sammanlänkat endotelskikt som liknar fysiologin hos det inre fodret i ett blodkärl . Således kräver funktionell analys av interaktioner mellan bakteriella patogener och värd kärl med mechanosensitive proteiner inrättandet av pumpsystem som kan simulera de fysiologiska flödes krafterna som är kända för att påverka ytan av vaskulära celler.

Den mikroflödessystem enhet som används i denna studie möjliggör en kontinuerlig och diskuterar återcirkulation av vätskor med en definierad flödeshastighet. Det datorstyrda luft trycks pumpsystemet tillämpar en definierad skjuvbelastning på endotelcellytor genom att generera ett kontinuerligt, enkelriktat och kontrollerat medium flöde. Morfologiska förändringar av cellerna och bakteriell kvarstad kan mikroskopiskt övervakas och kvantifieras i flödet med hjälp av speciella kanalbilder som är utformade för mikroskopisk visualisering. I motsats till statisk cellkultur infektion, som i allmänhet kräver ett prov fixering före immun märkning och mikroskopiska analyser, den mikroflödessystem slides möjliggöra både fluorescens-baserad detektion av proteiner, bakterier, och cellulära komponenter efter prov upptagning; seriell immunofluorescenscfärgning; och direkt fluorescensbaserad detektion i realtid. I kombination med fluorescerande bakterier och specifika fluorescensmärkta antikroppar, denna infektion förfarande ger en effektiv multipel komponent visualisering system för ett stort spektrum av vetenskapliga tillämpningar relaterade till vaskulära processer.

Introduction

Patogenesen av pneumokocker infektioner kännetecknas av en mångfacetterad interaktion med en mångfald av extracellulära matrix föreningar och komponenter i människans hemostas, såsom plasminogen ochVWF^{1,2, 3,4,5,6,7,8}. Den flera domäner glykoprotein VWF fungerar som nyckel regulator av en balanserad hemostas genom att förmedla trombocyter rekrytering och fibrin inkorporering vid platsen för vaskulär tromb formation⁹. Betydelsen av funktionell, aktiv VWF för blödningskontroll och sårläkning framgår av von Willebrands sjukdom, en vanlig ärftlig blödningssjukdom¹⁰.

Globulära VWF cirkulerar i det humana blodsystemet med en koncentration på upp till 14,0 μg/ml^11,10. Som svar på vaskulär skada, den lokala utgåvan av VWF av endotelceller Weibel Palade organ (WBP) är markant ökade^11,12. Tidigare studier visar att pneumokocker anslutning till humana endotelceller och dess produktion av Porbildande toxin pneumolysin stimulerar signifikant luminala VWF sekretion¹³. Blodflödets hydrodynamiska krafter inducerar en strukturell öppning av de mechanoresponsive VWF-domänerna. Vid flödeshastigheter på 10 dyn/cm² den VWF multimerizes till långa protein strängar på upp till flera hundra mikrometer i längd som förblir knutna till subendotelet^10,12.

För att förstå funktionen av multimerized VWF strängar som genereras under skjuvning stress i samspelet mellan pneumokocker med endoteliala ytan, en microfluidic-baserade cellkultur infektion strategi fastställdes. En mikrofluidisk enhet med ett programvarustyrt luft trycks pumpsystem användes. Detta möjliggjorde en kontinuerlig, enkelriktad återcirkulation av cellodlingsmedium med en definierad flödeshastighet. Därmed applicerade systemet en definierad skjuvning spänning på ytbehandla av endotelceller celler, som återstod fäst insida specialiserade kanaliserar glidbanor. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde simuleringen av skjuvning kraft inom blodströmmen av det mänskliga vaskulära systemet, där VWF strängar genereras på differentierade endotelceller under definierade konstanta flödesförhållanden. I detta syfte odlades endotelcellerna i specifika kanalbilder (se tabell över material), som anpassades för mikroskopiska analyser underflödet. Mikroflödessystem pumpsystem som den mycket definierade och kontrollerade skjuvning stress situation som krävs för bildandet av utökade VWF strängar på konfluenta endotelceller cell skiktet. Efter stimulering av VWF-utsöndring av samverkande odlas mänskliga navel ven endotelceller (HUVEC) av histamin tillskott, var strängen bildandet induceras genom att tillämpa en skjuvning stress (ԏ) av 10 dyn/cm². Skjuvspänningen definieras som den kraft som verkar på cell skiktet. Den beräknas ungefär enligt Cornish et. Al.¹⁴ med ekvation 1:

Där ԏ = skjuvning stress i dyn/cm², η = viskositet i (dyn ∙ s)/cm², h = halva kanalens höjd, w = hälften av kanalbredden, och Φ = flöde i ml/min.

Resultatet av ekvation 1 beror på de olika höjderna och bredderna för de olika bilderna som används (se tabell över material). I denna studie användes en Luerkanalslide på 0,4 μm, vilket resulterade i en kammar bild faktor på 131,6 (se formel 2).

Viskositeten hos mediet vid 37 ° c är 0,0072 dyn ∙ s/cm ² och en skjuvning stress på 10 dyn/cm ² användes. Detta resulterade i en flödeshastighet på 10,5 mL/min (se formel 3).

Här beskrivs anpassning och avancemang av en mikroflödessystem cell odlings procedur med hjälp av ett enkelriktat laminärt flödessystem för utredning och visualisering av bakteriella infektions mekanismer i värd kärlsystemet i detalj. Generering av VWF strängar på endotelskikt kan också stimuleras genom att använda andra pumpsystem som kan tillämpa en kontinuerlig och stadig skjuvning stress¹⁵.

Efter odling av primära endotelceller till sammanflödet i flödet och stimulering av VWF sträng formation, pneumokocker uttrycker rött fluorescens protein (RFP)¹⁶ lades till endotelcellskiktet under konstant mikroskopisk kontroll. Fastsättning av bakterier till VWF strängar på ytan av endotelceller var mikroskopiskt visualiseras och övervakas för upp till tre timmar i realtid med hjälp av VWF-specifika fluorescerande-märkta antikroppar. Med detta tillvägagångssätt, var den roll som VWF som en vidhäftning kofaktor främja bakteriell kvarstad på vaskulära endotelet bestämdes⁸.

Förutom den mikroskopiska visualiseringen av proteinsekretion och kon Formations förändringar, kan denna metod användas för att övervaka enstaka steg av bakteriella infektions processer i realtid och för att kvantifiera mängden bifogade bakterier vid olika tidpunkter i Infektion. Det specifika programvarustyrda pumpsystemet ger också möjlighet att odla endotelcellerna under definierade konstanta flödesförhållanden i upp till flera dagar och möjliggör en definierad inkubation mellan pulsade medel. Dessutom kan denna metod tillämpas med hjälp av olika celltyper. Anpassning av infärgnings protokollet möjliggör också detektion och visualisering av bakterier internaliseras i eukaryotiska celler.

Detta manuskript beskriver detta avancerade experimentella protokoll som kan användas som en definierad, tillförlitlig och reproducerbar metod för en effektiv och mångsidig karakterisering av patofysiologiska processer.

Protocol

Den mikroflödessystem cellodling utfördes med kommersiella primära mänskliga navel venen endotelceller (huvec). Företaget isolerade cellerna med informerat samtycke av givaren. Denna studie var godkänd vid etikkommittén av manipulerar kammaren av det federalt påstår Baden-Wuerttemberg med hänvisa till numrerar 219-04. Anmärkning: Se tabell över material för protokoll leveranser. 1. precultivation av primära endotelceller…

Representative Results

Odling primär huvec i ett konstant enkelriktat flöde resulterar i bildandet av ett konflytande och tätt packade cellskikt som främjar generering av cellulära wpbs fylld med den mechanosensitive VWF13,14. Detta protokoll beskriver användningen av en luft trycks pump-baserade, diskuterar cirkulationssystem för infektions analys som kräver imitera skjuvning stress situationen i människans blodflöde. Detta system möjliggör en d…

Discussion

Simuleringen av bakteriell interaktion med mechanosensitive Host proteiner såsom VWF kräver ett parfymera cellkultursystem som möjliggör generering av ett definierat, enkelriktat och kontinuerligt flöde av vätskor, vilket skapar tillförlitlig skjuvbelastning . Flera mikrofluidiska pumpsystem har redan beskrivits. En omfattande översyn från Bergmann et al. sammanfattar de viktigaste aspekterna av olika två-och tredimensionell cellkultur modeller¹⁷.

Den mikrofl?…

Materials

1 mL Luer-syringe	Fisher Scientific	10303002	with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe	Sarstedt	9077136	For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase	eBioscience now thermo fisher	00-4555-56	protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin	Abcam	ab176751	no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µl of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody	Thermo Fisher Sientific	A11001	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11011	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter	TPP	90026	subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	spinning down of bacteria (volumes of > 2mL)
Centrifuge Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 – Z 216 M	spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing	ibidi	10821	for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator	Fisher Scientific	MIDI 40	incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37°C and 5% CO2
CO2-Incubator	Sanyo	MCO-18 AIC	for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37°C
Colombia blood agar plates	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer	Dell	Latitude 3440	Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)	Leica	DMi8	An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	used for PBS buffer
Drying material	Merck	101969	orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix	Promocell	C-39215	supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 µg / mL heparin, 1 µg / mL Hydrocortisone
ECGMS	Promocell	C-22010	ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)	Promocell	C-22010	culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)	biochrome now Merck	S 0415	supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody	Abcam	ab8822	stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit	ibidi	10903	fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	for precoating of microslide channel surface
histamine dihydrochloride	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)	Santa Cruz	sc73268	stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port	ibidi	10820	for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope	Zeiss	Axiovert 35M	inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)	ibidi	80176	physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)	Sigma Aldrich	M7506-500G	For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump	ibidi	10905	air pressure pump
Neubauer cell counting chamber	Karl Hecht GmbH&Co KG	40442002	microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710-S	for cross linking of samples
Perfusion Set	ibidi	10964	Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37°C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)			the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes	Sarstedt	67,741	(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum	Pineda		raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate			this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)	ibidi	v1.5.4	Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
reaction tubes 1.5/ 2.0mL	Sarstedt	72.706/ 72.695.500	required for antibody dilutions
reaction tubes with 50 mL volume	Sarstedt	6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci	National Collection of Type Cultures, Public Health England	10,319	Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
serological pipets 5, 10 mL	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)	Sigma Aldrich	451614-25G	for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22	Biochrom	80-2115-20	measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G	for preparation of blocking buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract	oxoid	LP0021	bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY