在符合标准的基质上对人类胚胎干细胞菌落的几何结构进行模式化，以控制组织级力学
Summary
细胞外基质配体可以图案化在聚丙烯酰胺水凝胶上，使人类胚胎干细胞在符合要求的基质上的封闭菌落中培养。该方法可与牵引力显微镜和生化测定相结合，以检查组织几何、细胞生成力和命运规格之间的相互作用。
Abstract
人类胚胎干细胞通过细胞命运规范的自组织模式，在胚胎形成过程中与原发生殖层形成相对应，表现出独特的能力，对体外形态作出反应。因此，这些细胞是一个强大的工具，用以检查推动早期人类发展的机制。我们开发了一种方法，在符合要求的基质的密闭菌落体中培养人类胚胎干细胞，以控制菌落的几何及其机械环境，以便重新概括物理参数，胚胎发生的基础。该方法的主要特点是能够生成具有定义细胞外基质配体的形态的聚丙烯酰胺水凝胶，以促进细胞附着。这是通过制造具有所需几何图案的模具，使用这些模具在玻璃盖玻片上创建细胞外基质配体图案，并在聚合过程中将这些图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶中来实现的。该方法还与牵引力显微镜兼容，允许用户测量和绘制在密闭菌落区内细胞生成力的分布图。结合标准生化测定，这些测量可用于检查机械线索在早期人类发展过程中的命运规范和形态形成中的作用。
Introduction
人类胚胎干细胞（hESCs）在再生医学和组织工程应用中具有很大的应用前景。这些细胞的多能性质使它们能够分化成任何成人细胞类型。虽然在将hESCs的命运引向特定细胞类型方面已经取得巨大进展，但仍然很难产生整个组织或器官，即第1、2、3、4， 5.这在很大程度上是由于对在人类发展期间推动这些组织形成的机制了解有限。为了填补这一知识空白，近年来出现了一些方法，用胚胎干细胞6、7、8、9对早期胚胎及其发育阶段进行建模。 ，10，11，12，13.
在第一个hESC线14的产生后不久，证明由hESC形成的胚胎体能够自发地产生三个初级生殖层6的细胞。然而，由于对胚胎体的大小和形态固有的缺乏控制，生殖层组织差异很大，无法与早期胚胎的组织相匹配。最近，Warmflash等人开发了一种通过微模式将hESC的菌落限制在玻璃基板上的方法，从而对菌落8的大小和几何体提供控制和一致性。在BMP4（早期发育中的重要形态原）的存在下，这些受限菌落能够自组织地对代表主要生殖层的命运进行可重复的规格模式。虽然这为研究原始生殖层的建立机制提供了一个有用的模型，但命运规范的模式与胚胎发生过程中观察到的组织和形态形成不完全匹配。通过将hESCs嵌入母体11的三维细胞外基质（ECM）实现对早期胚胎发育的更忠实的回顾，为hESC自我组织和建模的能力提供了迄今为止最有力的证据胚胎形成的早期外体。但是，此方法会产生不一致的结果，因此与可用于揭示自组织和命运规范的基本机制的一些检测不兼容。
鉴于这些现有方法和各自的局限性，我们寻求开发一种方法，在模拟早期胚胎细胞外环境的条件下，对已定义的几何体的hESC菌落进行可重复的培养。为此，我们使用可调弹性的聚丙烯酰胺水凝胶来控制基材的机械性能。利用原子力显微镜对胃化阶段的鸡胚胎，我们发现表粒的弹性范围从几百帕斯卡到几千帕斯卡不等。因此，我们专注于生产具有弹性的聚丙烯酰胺水凝胶，作为hESC菌落的基质。我们修改了我们以前在聚丙烯酰胺水凝胶7、9上培养hESCs的方法，以对菌落的几何结构进行强有力的控制。我们通过首先将ECM配体（即母体凝胶）图案通过微制模具在玻璃盖上实现，如之前报道的16。然后，我们设计了一种新技术，在聚合过程中将图案配体转移到聚丙烯酰胺水凝胶的表面。我们在这里描述的方法包括使用光刻法来制造具有所需几何图案的硅晶片，用聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 创建这些几何特征的图章，并使用这些图章生成模具，最终允许配体图案到玻璃盖玻片表面，并转移到聚丙烯酰胺。
除了重述早期胚胎的机械环境外，将hESC菌落限制在聚丙烯酰胺上，还能用牵引力显微镜（TFM）测量细胞产生的力，如我们之前的方法9所述。简而言之，荧光珠可以嵌入聚丙烯酰胺，并用作基准标记。通过将 hESCs 播种到图案基板上后，通过成像这些磁珠的位移来计算细胞生成的力。此外，生成的牵引力图可与传统测定（如免疫染色）相结合，以检查在密闭的 hESC 菌落中细胞生成力的分布如何调节或调节下游信号。我们期望这些方法将揭示，机械力在细胞命运规范的模式设计中起着关键作用，而目前这种发育是被忽视的。
Protocol
Representative Results
Discussion
为了简化一个漫长而详细的协议，此方法包括三个关键阶段：1） 在玻璃盖玻片上生成 ECM 配体图案，2） 在凝胶聚合过程中将图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶，以及 3） 在图案水凝胶。在这三个阶段中，每个阶段都必须考虑一些关键步骤。为了在玻璃盖玻上生成高保真图案，必须将模具牢固地压在盖玻片上，以防止配体溶液泄漏，并且必须在向模具表面添加配体溶液后清除所有气泡（<strong class="xfig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们想感谢CIRM赠款RB5-07409的资助。J.M.M.感谢FuiBoon Kai、DhruvThakar和RogerOria为指导这种方法的生成和故障排除进行的各种讨论。J.M.M.还感谢UCSF发现奖学金对他的工作的持续支持。
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
