Patroon van de geometrie van menselijke embryonale stamcel kolonies op conforme ondergronden om de mechanismen van Weefselniveau te beheersen
Summary
Extracellulaire matrix liganden kunnen worden Gedessineerd op polyacrylamidehydrogels om de cultuur van menselijke embryonale stamcellen in kleine kolonies op conforme ondergronden mogelijk te maken. Deze methode kan worden gecombineerd met tractiekracht microscopie en biochemische testen om de wisselwerking tussen weefsel geometrie, door cellen gegenereerde krachten en de specificatie van het lot te onderzoeken.
Abstract
Menselijke embryonale stamcellen tonen een uniek vermogen om in vitro op morfogenen te reageren door zelforganiserende patronen van de specificatie van het lot van cellen die corresponderen met primaire kiem laagvorming tijdens de embryogenese. Dus, deze cellen vertegenwoordigen een krachtig instrument om te onderzoeken van de mechanismen die vroege menselijke ontwikkeling stimuleren. We hebben een methode ontwikkeld om menselijke embryonale stamcellen te kweken in kleine kolonies op conforme ondergronden die de controle over zowel de geometrie van de kolonies als hun mechanische omgeving bieden om de fysische parameters te recapituleren die ten grondslag embryogenese. Het belangrijkste kenmerk van deze methode is de mogelijkheid om polyacrylamidehydrogels te genereren met gedefinieerde patronen van extracellulaire matrix ligand aan de oppervlakte om celhechting te bevorderen. Dit wordt bereikt door het vervaardigen van stencils met de gewenste geometrische patronen, met behulp van deze stencils te maken patronen van extracellulaire matrix ligand op glas dekstroken, en overbrengen van deze patronen naar Polyacrylamide hydrogels tijdens polymerisatie. Deze methode is ook compatibel met de tractiekracht microscopie, waardoor de gebruiker de verdeling van de door cellen gegenereerde krachten binnen de besloten kolonies kan meten en toewijzen. In combinatie met standaard biochemische testen, kunnen deze metingen worden gebruikt om de rol van mechanische cues spelen in Fate specificatie en morfogenese tijdens de vroege menselijke ontwikkeling te onderzoeken.
Introduction
Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) houden grote belofte voor gebruik in regeneratieve geneeskunde en weefsel engineering toepassingen. De pluripotente aard van deze cellen geeft hen de mogelijkheid om onderscheid te maken in een volwassen celtype. Hoewel er grote vooruitgang is geboekt bij het sturen van het lot van hESCs naar bepaalde celtypen, is het erg moeilijk gebleven om hele weefsels of organen de Novo1,2,3,4te genereren, 5. Dit is grotendeels te wijten aan een beperkt begrip van de mechanismen die de vorming van deze weefsels tijdens de menselijke ontwikkeling stimuleren. Om deze kloof in kennis te dichten, zijn er de afgelopen jaren een aantal methoden ontstaan om het vroege embryo en de daaropvolgende ontwikkelingsstadia te modelleren met embryonale stamcellen6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Kort na de afleiding van de eerste hESC-lijnen14werd aangetoond dat embryoïde lichamen gevormd uit hescs in staat waren om spontaan cellen te produceren van de drie primaire kiem lagen6. Door het inherente gebrek aan controle over de grootte en morfologie van embryoïde lichamen varieerde de organisatie van kiem lagen echter aanzienlijk en slaagde er niet in om de organisatie van het vroege embryo te matchen. Meer recentelijk heeft Warmflash et al. een methode ontwikkeld om kolonies van hESCs op glas substraten te beperken via micropatterning, wat controle en consistentie biedt over de grootte en geometrie van de kolonies8. In aanwezigheid van BMP4, een belangrijke morfogen in de vroege ontwikkeling, waren deze besloten kolonies in staat om zelforganiserende reproduceerbare patronen van specificatie te geven aan lot die de primaire kiem lagen representeren. Hoewel dit een nuttig model voor het bestuderen van de mechanismen waarmee primaire kiem lagen zijn vastgesteld, de patronen van het lot specificatie niet precies overeenkomen met de organisatie en morfogenese waargenomen tijdens embryogenese15. Een meer getrouwe recapitulatie van de vroege embryonale ontwikkeling werd bereikt door het insluiten van hESCs in een driedimensionale extracellulaire matrix (ECM) van matrigel11, die tot op heden het sterkste bewijs levert voor het vermogen van hescs om zichzelf te organiseren en model de vroege stadia van embryogenese ex vivo. Deze methode levert echter inconsistente resultaten op en is dus onverenigbaar met een aantal assays die kunnen worden gebruikt om de onderliggende mechanismen van zelforganisatie en Fate specificatie te onthullen.
Gezien deze bestaande methodes en hun respectieve beperkingen, probeerden we een methode te ontwikkelen voor het reproduceren van hESC-kolonies met gedefinieerde geometrieën onder omstandigheden die de extracellulaire omgeving van het vroege embryo modelleren. Om dit te bereiken gebruikten we Polyacrylamide hydrogels van instelbare elasticiteit om de mechanische eigenschappen van het substraat te beheersen. Met behulp van atoom kracht microscopie op gastrulatie-stage kippen embryo’s, vonden we dat de elasticiteit van de epiblast varieerde van honderden pascal’s tot een paar kilopascals. Zo richtten we ons op het opwekken van polyacrylamide hydrogels met elasticiteit in dit bereik om te dienen als substraat voor hESC-kolonies. We hebben onze eerdere methoden voor het kweken van hescs op Polyacrylamide hydrogels7,9 aangepast om een robuuste controle te bieden over de geometrie van de kolonies. Dit hebben we bereikt door eerste patronen ECM ligands, namelijk matrigel, op glazen dekstroken via micro fabricaat stencils, zoals eerder gerapporteerd16. Vervolgens ontwierpen we een nieuwe techniek om het patroon ligand over te brengen naar het oppervlak van polyacrylamidehydrogels tijdens polymerisatie. De methode die we hier beschrijven, is het gebruik van foto lithografie om een silicium wafer te fabriceren met de gewenste geometrische patronen, het maken van postzegels van deze geometrische kenmerken met Polydimethylsiloxaan (PDM’S), en het gebruik van deze stempels om de stencils te genereren die uiteindelijk toestaan van het patroon van ligand op het oppervlak van glas dekstroken en overbrengen naar Polyacrylamide.
Naast het samenstellen van de mechanische omgeving van het vroege embryo, maakt het beperken van hESC-kolonies op Polyacrylamide het mogelijk om door cellen gegenereerde krachten te meten met tractiekracht microscopie (TFM), zoals gerapporteerd in onze vorige methode9. In het kort, fluorescerende kralen kunnen worden ingebed in de Polyacrylamide en gebruikt als fiducial markers. Door de cel gegenereerde krachten worden berekend door de verplaatsing van deze kralen te vervormen na het zaaien van hESCs op het patroon substraat. Bovendien kunnen de resulterende tractiekracht kaarten worden gecombineerd met traditionele assays, zoals immunokleuring, om te onderzoeken hoe de verdeling van door cellen gegenereerde krachten in kleine hESC kolonies de downstream signalering kan reguleren of moduleren. We verwachten dat deze methoden zullen onthullen dat mechanische krachten een cruciale rol spelen in het patroon van de specificatie van het lot van cellen tijdens de vroege embryonale ontwikkeling die momenteel over het hoofd wordt gezien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om een lang en gedetailleerd protocol te vereenvoudigen, bestaat deze methode uit drie kritieke stadia: 1) het genereren van patronen van ECM ligand op glazen Dekbladen, 2) het overbrengen van de patronen naar polyacrylamidehydrogels tijdens polymerisatie van de gel, en 3) het zaaien van hESCs op de gedessineerde hydrogel. Er zijn kritieke stappen die in elk van deze drie fasen moeten worden overwogen. Om high-fidelity patronen op de glazen dekstroken te genereren, moet het stencil stevig op de afdekplaat worden gedrukt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen graag de financiering van CIRM Grant RB5-07409 erkennen. J.M.M. wil FuiBoon Kai, Dhruv Thakar en Roger Oria bedanken voor verschillende discussies die de generatie en het oplossen van deze methode begeleidde. J.M.M. dankt ook de UCSF Discovery Fellowship voor de voortdurende ondersteuning van zijn werk.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
