조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝
Summary
세포외 매트릭스 리간드는 폴리아크릴아미드 하이드로겔에 패턴화되어 밀폐된 콜로니에서 인간 배아 줄기 세포의 배양을 준수기판에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 견인력 현미경 검사법 및 생화학 적 분석을 결합하여 조직 기하학, 세포 생성 힘 및 운명 사양 간의 상호 작용을 검사 할 수 있습니다.
Abstract
인간 배아 줄기 세포는 배아 발생 시 1차 생식층 형성에 대응하는 세포 운명 사양의 자가 조직화 패턴에 의해 시험관내 모르포겐에 반응하는 독특한 능력을 입증한다. 따라서, 이 세포는 초기 인간 발달을 이끄는 기계장치를 검토하는 강력한 공구를 나타냅니다. 우리는 물리적 인 매개 변수를 재현하기 위해 식민지의 기하학과 기계적 환경 모두를 제어 할 수있는 준수 기질에 제한된 식민지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개발했습니다. 배아 발생의 기초. 이 방법의 주요 특징은 세포 부착을 촉진하기 위해 표면에 세포 외 매트릭스 리간드의 정의 된 패턴과 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 생성하는 능력이다. 이것은 원하는 기하학적 패턴으로 스텐실을 제작하고, 이러한 스텐실을 사용하여 유리 커버슬립에 세포외 매트릭스 리간드패턴을 생성하고, 중합 중에 이러한 패턴을 폴리아크릴아미드 하이드로겔로 옮기는 것으로 달성됩니다. 이 방법은 또한 견인력 현미경 검사법과 호환되므로 사용자는 제한된 식민지 내에서 세포 생성 힘의 분포를 측정하고 매핑할 수 있습니다. 표준 생화학 분석과 함께, 이러한 측정은 초기 인간 개발 동안 운명 사양 및 형태 발생에서 기계적 단서가 재생역할을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 재생 의학 및 조직 공학 응용 분야에서 사용하기위한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 이 세포의 다능성 성질은 그(것)들에게 어떤 성숙한 세포 모형으로 분화하는 기능을 줍니다. 특정 세포 유형에 hESCs의 운명을 지시에 큰 진전이 이루어진 동안, 그것은 전체 조직 또는 장기 de novo1,2,3,4를생성하는 것은 매우 어려운 남아있다 5. 이것은, 상당 부분에서, 인간 발달 도중 이 조직의 대형을 몰기 하는 기계장치의 한정된 이해 때문이. 지식의 이 격차를 메우기 위하여는, 배아줄기세포6,7,8,9를 가진 발달의 초기 태아 그리고 후속 단계를 모델링하는 방법의 수는 최근에 나타났습니다 ,10,11,12,13.
제1 hESC라인(14)의유도 직후, hESCs로부터 형성된 배아체가 3차 생식층6의세포를 자발적으로 생성할 수 있음을 입증하였다. 그러나, 배아 체의 크기와 형태에 대한 통제의 본질적인 부족으로 인해, 배아 층의 조직은 크게 변화하고 초기 배아의 조직과 일치하지 못했다. 최근에는 Warmflash 등은 미세 패터닝을 통해 유리 기판에 hES의 식민지를 제한하는 방법을 개발하여 식민지의 크기와 기하학에 대한 제어 및 일관성을 제공합니다8. 초기 개발에서 중요한 모르포겐인 BMP4의 존재에서, 이러한 제한된 식민지는 1 차적인 세균 층을 나타내는 운명에 명세의 재현 가능한 패턴을 스스로 조직할 수 있었습니다. 이는 1차 생식층이 확립되는 기전을 연구하기 위한 유용한 모델을 제공했지만, 운명 명세의 패턴은 배아 발생 시 관찰된 조직 및 형태 형성과 정확하게 일치하지 않았다15. 초기 배아 발달의 보다 충실한 재수집은 matrigel11의3차원 세포 외 매트릭스(ECM)에 hESCs를 포함시킴으로써 달성되었으며, hESCs가 스스로 구성하고 모델링할 수 있는 능력에 대한 가장 강력한 증거를 제공합니다. 배아 발생 의 초기 단계 ex 생체. 그러나, 이 방법은 일관되지 않은 결과를 산출하고 따라서 자기 조직과 운명 명세의 근본적인 기계장치를 드러내기 위하여 이용될 수 있는 다수의 수의 검사와 호환되지 않습니다.
이러한 기존 방법과 각각의 한계를 감안할 때, 우리는 초기 배아의 세포 외 환경을 모델링하는 조건에서 정의 된 기하학의 hESC 콜로니를 재현 가능하게 배양하는 방법을 개발하고자했습니다. 이를 달성하기 위해, 우리는 기판의 기계적 특성을 제어하기 위해 조정 탄성의 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔을 사용했다. 위분화 단계 닭 배아에 원자력 현미경 검사법을 사용하여, 우리는 epiblast의 탄성이 몇 킬로파스칼에 파스칼의 수백에서 구역 수색한다는 것을 것을을 발견했습니다. 따라서, 우리는 hESC 식민지를 위한 기판역할을 하기 위하여 이 범위에서 탄성을 가진 폴리아크릴아미드 하이드로겔생성에 집중했습니다. 우리는 콜로니의 기하학에 대한 강력한 제어를 제공하기 위해 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔7,9에 hCS를 배양하기위한 우리의 이전 방법을 수정했습니다. 우리는 이전에 보고 된바와같이, 마이크로 패브릭 스텐실을 통해 유리 커버 슬립에 ECM 리간드, 즉 matrigel을 먼저 패터닝하여 이를 달성했습니다. 그런 다음 중합 중에 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 표면으로 패턴 리간드를 전달하는 새로운 기술을 설계했습니다. 여기서 설명하는 방법은 포토리소그래피를 사용하여 원하는 기하학적 패턴으로 실리콘 웨이퍼를 제작하고, 다디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 기하학적 특징의 스탬프를 만들고, 이러한 스탬프를 사용하여 스텐실을 생성하는 것을 포함합니다. 궁극적으로 유리 커버립의 표면에 리간드의 패터닝을 허용립과 폴리 아크릴 아미드로 전송.
초기 배아의 기계적 환경을 재요약하는 것 외에도, 폴리아크릴아미드에 hESC 콜로니를 제한하면 이전 방법9에보고된 바와 같이 견인력 현미경(TFM)으로 세포 생성 힘을 측정할 수 있습니다. 간단히 말해서, 형광 비드는 폴리아크릴아미드에 내장되어 수화물 마커로 사용될 수 있다. 세포 생성 힘은 패턴화된 기판 상에 hESCs를 시드한 후 이러한 비드의 변위를 이미징하여 계산됩니다. 또한, 생성된 견인력 맵은 면역 염색과 같은 전통적인 분석과 결합되어 제한된 hESC 콜로니에서 세포 생성 힘의 분포가 다운스트림 신호를 조절하거나 조절하는 방법을 조사할 수 있습니다. 우리는 이 방법들이 기계적 힘이 현재 간과되는 초기 배아 발달 도중 세포 운명 명세의 패터닝에 중요한 역할을 한다는 것을 밝힐 것으로 기대합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
길고 상세한 프로토콜을 단순화하기 위해, 이 방법은 세 가지 중요한 단계로 구성되어 있습니다 : 1) 유리 커버립에 ECM 리간드의 생성 패턴, 2) 겔의 중합 동안 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔로 패턴을 전송, 3) 에 시종 hESCs 패턴 하이드로겔. 이 세 단계 각각에서 고려해야 할 중요한 단계가 있습니다. 유리 커버립에 고충실도 패턴을 생성하기 위해 스텐실은 리간드 용액의 누출을 방지하기 위해 커?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 CIRM 교부금 RB5-07409에서 자금을 인정하고 싶습니다. J.M.M.은 이 방법의 생성과 문제 해결을 안내하는 다양한 토론에 대해 푸이분 카이, 드루프 타카르, 로저 오리아에게 감사드립니다. J.M.M.은 또한 UCSF 디스커버리 펠로우십에 그의 작품을 지속적으로 지원해 준 것에 감사드립니다.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
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