Inducerende posttraumatische epilepsie in een muis model van repetitive diffuse traumatisch hersenletsel

Summary

Dit systematische protocol beschrijft een nieuw diermodel van posttraumatische epilepsie na repetitief licht traumatisch hersenletsel. Het eerste deel details stappen voor traumatisch hersenletsel inductie met behulp van een gewijzigd gewicht daling model. Het tweede deel geeft instructies over de chirurgische aanpak voor single- en multi-channel elektro-encefalografische data-acquisitiesystemen.

Abstract

Traumatisch hersenletsel (TBI) is een belangrijke oorzaak van verworven epilepsie. TBI kan leiden tot een brandpunts- of diffuus hersenletsel. Focal eerletsel is een gevolg van directe mechanische krachten, soms penetreren door de schedel, het creëren van een directe laesie in het hersenweefsel. Deze zijn zichtbaar tijdens de beeldvorming van de hersenen als gebieden met kneuzing, snijwond en bloeding. Focale laesies veroorzaken neuronale dood en glialittekenvorming en zijn aanwezig in 20%−25% van alle mensen die een TBI oplopen. In de meeste Gevallen van TBI wordt letsel echter veroorzaakt door versnellingsvertragingskrachten en daaropvolgende weefselafhoorwerken, wat resulteert in niet-focale, diffuse schade. Een subpopulatie van TBI-patiënten blijft posttraumatische epilepsie (PTE) ontwikkelen na een latentieperiode van maanden of jaren. Momenteel is het onmogelijk om te voorspellen welke patiënten PTE zullen ontwikkelen, en aanvallen bij PTE-patiënten zijn een uitdaging om te controleren, wat verder onderzoek noodzakelijk maakt. Tot voor kort was het veld beperkt tot slechts twee dier/knaagdiermodellen met gevalideerde spontane posttraumatische aanvallen, beide met grote brandpuntslaesies met enorm weefselverlies in de cortex en soms subcorticale structuren. In tegenstelling tot deze benaderingen werd vastgesteld dat diffuse TBI-geïnduceerde met behulp van een gewijzigd gewichtsvalmodel voldoende is om de ontwikkeling van spontane krampachtige en niet-krampende aanvallen in gang te zetten, zelfs bij afwezigheid van brandpuntslaesies of weefselverlies. Vergelijkbaar met menselijke patiënten met verworven posttraumatische epilepsie, dit model presenteert met een latentie periode na letsel voor het begin van de aanval. In dit protocol zal de gemeenschap worden voorzien van een nieuw model van posttraumatische epilepsie, waarin wordt beschreven hoe diffuse niet-lesional TBI kan worden veroorzaakt, gevolgd door continue langdurige video-elektroencephalografische diermonitoring in de loop van enkele maanden. Dit protocol zal de behandeling van dieren, de gewichtsvalprocedure, de elektrodeplaatsing voor twee acquisitiesystemen en de frequente uitdagingen die tijdens elk van de stappen van chirurgie, postoperatieve monitoring en gegevensverwerving worden ondervonden, detailleren.

Introduction

Elk jaar treft TBI naar schatting 60 miljoen mensen wereldwijd. Getroffen personen lopen een hoger risico op het ontwikkelen van epilepsie, die zich jaren na het initiële letsel kan manifesteren. Hoewel ernstige Tbs’jes gepaard gaan met een hoger risico op epilepsie, verhoogt zelfs milde TBI de kans van een individu op het ontwikkelen van epilepsie^1,2,3,4. Alle TBI’s kunnen worden geclassificeerd als focale, diffuse, of een combinatie van beide. Diffuus hersenletsel, aanwezig in veel, zo niet alle TBC’s, is een gevolg van hersenweefsels van verschillende dichtheden scheren tegen elkaar als gevolg van versnelling-vertraging en rotatiekrachten. Diffuus letsel komt per definitie alleen in isolatie voor in mild/concussief niet-penetrerend hersenletsel, waarbij geen hersenletsels zichtbaar zijn op computertomografiescans⁵.

Er zijn momenteel twee kritieke problemen in de behandeling van patiënten die posttraumatische epilepsie (PTE) hebben of lopen. De eerste is dat zodra PTE zich heeft gemanifesteerd, aanvallen resistent zijn tegen beschikbare anti-epileptica (AED’s)⁶. Ten tweede zijn AED’s even ondoeltreffend in het voorkomen van epileptogenese, en er zijn geen effectieve alternatieve therapeutische benaderingen. Om dit tekort aan te pakken en betere therapeutische doelen en behandelingskandidaten te vinden, zal het nodig zijn om nieuwe cellulaire en moleculaire mechanismen aan de wortel van PTE⁶te verkennen.

Een van de prominente kenmerken van posttraumatische epilepsie is de latente periode tussen de eerste traumatische gebeurtenis en het begin van spontane, niet-uitgelokte, terugkerende aanvallen. De gebeurtenissen die zich voordoen binnen dit tijdelijke venster zijn een natuurlijke focus voor onderzoekers, omdat dit tijdvenster de behandeling en preventie van PTE helemaal mogelijk zou kunnen maken. Diermodellen worden meestal gebruikt voor dit onderzoek omdat ze verschillende voordelen bieden, niet de minste daarvan is dat continue monitoring van menselijke patiënten zowel onpraktisch als kostbaar zou zijn over een dergelijke potentieel lange tijdspanne. Bovendien kunnen cellulaire en moleculaire mechanismen aan de wortel van epileptogenese alleen worden onderzocht in diermodellen.

Diermodellen met spontane posttraumatische aanvallen en epilepsie hebben de voorkeur boven modellen waarbij aanvallen na TBI worden geïnduceerd door minder fysiologisch relevante middelen, zoals door chemoconvulsants of elektrische stimulatie acuut, chronisch of door aanmaak. Spontane posttraumatische epileptische aanvalsmodellen testen hoe TBI het gezonde hersennetwerk wijzigt dat leidt tot epileptogenese. Studies met behulp van extra stimulatie na TBI beoordelen hoe blootstelling aan TBI de aanvalsdrempel vermindert en de gevoeligheid voor aanvallen beïnvloedt. De voordelen van diermodellen met chemische aanvallen of elektrische stimulatie zijn het testen van de specifieke mechanismen van refractoriness aan AED’s en de werkzaamheid van bestaande en nieuwe AED’s. De mate van relevantie en vertaling van deze gegevens naar de mens kan echter dubbelzinnig zijn⁷ als gevolg van het volgende: 1) inbeslagnemingsmechanismen kunnen verschillen van die welke alleen door TBI worden veroorzaakt; 2) niet al deze modellen leiden tot spontane aanvallen⁷; 3) laesies gecreëerd door het convulsieve middel zelf, met de canule die nodig is voor de levering ervan, of door het stimuleren van elektrode plaatsing in dieptestructuren (bijvoorbeeld de hippocampus of amygdala) kan al leiden tot verhoogde inbeslagneming gevoeligheid en zelfs hippocampal epileptiform veld potentials⁷. Bovendien produceren sommige convulsieve middelen (d.w.z. kaionzuur) directe hippocampallaesies en sclerose, wat niet typisch is na diffuse TBI.

Tot voor kort bestonden er slechts twee diermodellen van posttraumatische epilepsie: gecontroleerde corticale impact (CCI, focal) of vochtpercussieletsel (FPI, focal en diffuus)⁸. Beide modellen resulteren in grote brandpuntslaesies naast weefselverlies, bloeding en gliosis bij knaagdieren⁸. Deze modellen bootsen posttraumatische epilepsie na die door grote brandpuntslaesies wordt veroorzaakt. Een recente studie toonde aan dat herhaalde (3x) diffuus TBI voldoende is voor de ontwikkeling van spontane aanvallen en epilepsie bij muizen, zelfs bij afwezigheid van focale laesies⁹, het toevoegen van een derde knaagdier PTE-model met bevestigde spontane terugkerende aanvallen. Dit nieuwe model bootst cellulaire en moleculaire veranderingen veroorzaakt door diffuse TBI na, beter vertegenwoordigen van de menselijke bevolking met milde, gelijktijdige TBI’s. In dit model, de latente periode van drie weken of meer voor het begin van de aanval en de opkomst van de late, spontane, terugkerende aanvallen maakt het mogelijk om het onderzoeken van de onderliggende oorzaken van posttraumatische epileptogenese, het testen van de werkzaamheid van preventieve benaderingen en nieuwe therapeutische kandidaten na de aanval begin, en heeft potentieel voor de ontwikkeling van biomarkers van post-traumatische epileptogenese, omdat ongeveer de helft van de dieren ontwikkelen posttraumatische epilepsie.

De keuze van het diermodel voor de studie van posttraumatische epilepsie hangt af van de wetenschappelijke vraag, het onderzochte type hersenletsel en welke instrumenten zullen worden gebruikt om de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen te bepalen. Uiteindelijk moet elk model van posttraumatische epilepsie zowel het ontstaan van spontane aanvallen na TBI als een eerste latentieperiode in een subgroep van TBI-dieren aantonen, omdat niet alle patiënten die een TBI oplopen, epilepsie ontwikkelen. Hiervoor wordt elektro-encefalografie (EEG) met gelijktijdige video-acquisitie gebruikt in dit protocol. Inzicht in de technische aspecten achter data-acquisitie hardware en benaderingen is van cruciaal belang voor nauwkeurige gegevensinterpretatie. De kritieke hardwareaspecten omvatten het type opnamesysteem, type elektroden (schroef of draadlood) en materiaal dat zij van worden gemaakt, gesynchroniseerde videoaanwinst (als deel van het systeem EEG of derde partij), en eigenschappen van het computersysteem. Het is absoluut noodzakelijk om de juiste acquisitieparameters in elk type systeem vast te stellen, afhankelijk van het studiedoel, eeg-gebeurtenissen van belang, verdere analysemethode en duurzaamheid van gegevensopslag. Ten slotte moet de methode van elektrodeconfiguratie (montage) worden overwogen, omdat elk van deze maatregelen en nadelen heeft en de interpretatie van de gegevens zal beïnvloeden.

Dit protocol beschrijft hoe het gewijzigde Marmarou-gewichtsvalmodel^10,11 moet worden gebruikt om diffuus letsel te veroorzaken, wat resulteert in spontane, niet-uitgelokte, terugkerende aanvallen bij muizen, beschrijft chirurgische benaderingen om een single- en multi-channel continue, en gesynchroniseerde video-EEG te verkrijgen met behulp van monopolaire, bipolaire of gemengde montage.

Protocol

Alle dierprocedures beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Virginia Tech en in overeenstemming met de National Institutes of Health’s ‘Guide for the Care and Use of Laboratory Animals’ . 1. Protocol inzake de behandeling van dieren OPMERKING: Dit protocol is bedoeld om dieren die na aankomst bij een verkoper naar de faciliteit worden besteld te wenning en om te voorzien dat ze door…

Representative Results

Het hier beschreven protocol beschrijft de methode voor inductie van een diffuus letsel in isolatie (bijvoorbeeld bij afwezigheid een brandpuntslaesie) met behulp van een muismodel van repetitieve diffuse TBI(figuur 1). Figuur 1A toont het gewichtsvalapparaat en de componenten daarvan ( figuur1A, a1−a5) die worden gebruikt voor inductie van TBI in dit model en cruciale stappen tijdens de procedure…

Discussion

In tegenstelling tot CCI- en FPI-modellen die focale of combinatie van brandpunts- en diffuse verwondingen veroorzaken, maakt het model van repetitieve diffuse TBI, beschreven in dit protocol, de inductie van diffuus letsel mogelijk bij afwezigheid van brandpuntshersenletsel en vereist geen hoofdhuid- of schedelopeningen en de bijbehorende ontsteking. Een bijkomend voordeel van de afwezigheid van craniectomie in dit model is dat het niet alleen mogelijk maakt om de elektroden te implanteren voor chronische continue EEG-o…

Materials

0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB