Induire l’épilepsie post-traumatique dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques diffuses répétitives

Summary

Ce protocole systématique décrit un nouveau modèle animal de l’épilepsie post-traumatique après des dommages légers répétitifs de cerveau. La première partie détaille les étapes de l’induction des lésions cérébrales traumatiques à l’aide d’un modèle modifié de baisse de poids. La deuxième partie fournit des instructions sur l’approche chirurgicale pour les systèmes d’acquisition de données électroencéphalographiques à un seul et à plusieurs canaux.

Abstract

Les lésions cérébrales traumatiques (ITT) sont l’une des principales causes d’épilepsie acquise. TBI peut entraîner une lésion cérébrale focale ou diffuse. Les lésions focales sont le résultat de forces mécaniques directes, pénétrant parfois à travers le crâne, créant une lésion directe dans le tissu cérébral. Ceux-ci sont visibles pendant l’imagerie cérébrale comme zones avec la contusion, la cécité, et l’hémorragie. Les lésions focales induisent la mort neuronale et la formation de cicatrices gliales et sont présentes dans 20% -25% de toutes les personnes qui encourent un TBI. Cependant, dans la majorité des cas de TBI, les dommages sont provoqués par des forces d’accélération-décélération et le cisaillement suivant de tissu, ayant pour résultat des dommages non focals et diffus. Une sous-population de patients atteints de TBI continue de développer une épilepsie post-traumatique (TP) après une période de latence de mois ou d’années. Actuellement, il est impossible de prédire quels patients développeront le PTE, et les saisies dans les patients de PTE sont difficiles à commander, nécessitant davantage de recherche. Jusqu’à récemment, le champ était limité à seulement deux modèles d’animaux/rongeurs avec des saisies post-traumatiques spontanées validées, présentant toutes deux de grandes lésions focales avec la perte massive de tissu dans le cortex et parfois les structures subcorticales. Contrairement à ces approches, il a été déterminé que le TBI diffus induit à l’aide d’un modèle modifié de baisse de poids est suffisant pour initier le développement des saisies convulsives spontanées et non convulsives, même en l’absence de lésions focales ou de perte de tissu. Semblable aux patients humains présentant l’épilepsie post-traumatique acquise, ce modèle présente avec une période de latence après des dommages avant le début de saisie. Dans ce protocole, la communauté recevra un nouveau modèle d’épilepsie post-traumatique, détaillant comment induire le TBI diffus non-lésionnel suivi d’une surveillance continue à long terme des animaux vidéo-électroencéphalographiques au cours de plusieurs mois. Ce protocole détaillera la manipulation des animaux, la procédure de chute de poids, le placement d’électrodes pour deux systèmes d’acquisition, et les défis fréquents rencontrés pendant chacune des étapes de la chirurgie, de la surveillance postopératoire et de l’acquisition de données.

Introduction

Chaque année, l’ITC touche environ 60 millions de personnes dans le monde. Les personnes touchées sont plus à risque de développer une épilepsie, qui peut se manifester des années après la blessure initiale. Bien que les TBI graves soient associés à un risque plus élevé d’épilepsie, même l’ITC léger augmente le risque d’épilepsie d’une personne^1,2,3^,4. Tous les TBI peuvent être classés comme focaux, diffus ou une combinaison des deux. Les lésions cérébrales diffuses, présentes dans de nombreux, sinon tous les TCI, sont le résultat de tissus cérébraux de différentes densités de cisaillement les uns contre les autres en raison de l’accélération-décélération et des forces de rotation. Par définition, les dommages diffus se produit seulement dans l’isolement dans les dommages non-pénétrants doux/châtessifs de cerveau, dans lesquels aucune lésion de cerveau n’est visible sur des balayages de tomographie^{calculées 5.}

Il y a actuellement deux problèmes critiques dans la prise en charge des patients qui ont, ou sont à risque de développer, l’épilepsie post-traumatique (PTE). La première est qu’une fois que le PTE s’est manifesté, les convulsions sont résistantes aux médicaments antiépileptiques disponibles (DEA)⁶. Deuxièmement, les DEA sont également inefficaces pour prévenir l’épileptogénèse, et il n’existe pas d’approches thérapeutiques alternatives efficaces. Afin de combler ce déficit et de trouver de meilleures cibles thérapeutiques et des candidats pour le traitement, il sera nécessaire d’explorer de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires à la racine de PTE⁶.

Une des caractéristiques principales de l’épilepsie post-traumatique est la période latente entre l’événement traumatique initial et le début des saisies spontanées, non provoquées, récurrentes. Les événements qui se produisent dans cette fenêtre temporelle sont un foyer naturel pour des chercheurs, parce que cette fenêtre de temps pourrait permettre le traitement et la prévention de PTE tout à fait. Les modèles animaux sont le plus couramment utilisés pour cette recherche parce qu’ils offrent plusieurs avantages distincts, dont le moindre n’est pas que la surveillance continue des patients humains serait à la fois peu pratique et coûteux sur de telles périodes potentiellement longues. En outre, les mécanismes cellulaires et moléculaires à la racine de l’épileptogenèse ne peuvent être explorés que dans les modèles animaux.

Les modèles animaux avec des crises post-traumatiques spontanées et l’épilepsie sont préférés aux modèles où les saisies sont induites après TBI par des moyens moins physiologiquement pertinents, tels que par des chimioconvulsants ou la stimulation électrique aigu, chronique, ou par l’allumeur. Les modèles post-traumatiques spontanés de saisie testent comment TBI modifie le réseau sain de cerveau menant à l’épileptogenèse. Les études utilisant la stimulation additionnelle après TBI évaluent comment l’exposition au TBI réduit le seuil de saisie et affecte la susceptibilité aux saisies. Les avantages des modèles animaux avec des saisies induites chimiquement ou avec la stimulation électrique sont en testant les mécanismes spécifiques de réfractaire aux DEA et l’efficacité des DEA existants et nouveaux. Pourtant, le degré de pertinence et de traduction de ces données à l’homme peut être ambigu⁷ en raison de ce qui suit: 1) les mécanismes de saisie peuvent être différents de ceux induits par TBI seul; 2) tous ces modèles ne conduisent pas à des crises spontanées⁷; 3) les lésions créées par l’agent convulsif lui-même, avec la canule requise pour sa livraison, ou en stimulant le placement d’électrodes dans les structures de profondeur (par exemple, l’hippocampe ou l’amygdale) peuvent déjà causer une susceptibilité accrue de saisie et même des potentiels épileptiformes hippocampiformes de champ^7. En outre, certains agents convulsivants (c.-à-d., acide kainique) produisent des lésions hippocampales directes et la sclérose, qui n’est pas typique après TBI diffus.

Jusqu’à récemment, il n’existait que deux modèles animaux d’épilepsie post-traumatique : l’impact cortical contrôlé (ICC, focal) ou les blessures par percussion selle fluide (FPI, focale et diffuse)⁸. Les deux modèles ont comme conséquence de grandes lésions focales à côté de la perte de tissu, de l’hémorragie, et de la gliose dans les rongeurs^8. Ces modèles imitent l’épilepsie post-traumatique induite par de grandes lésions focales. Une étude récente a démontré que le TBI diffus répété (3x) est suffisant pour le développement des saisies spontanées et de l’épilepsie chez les souris même en l’absence des lésions focales^9,ajoutant un troisième modèle de PTE de rongeur avec des saisies récurrentes spontanées confirmées. Ce nouveau modèle imite les changements cellulaires et moléculaires induits par l’ITC diffuse, représentant mieux la population humaine avec des TBI légers et cisussifs. Dans ce modèle, la période latente de trois semaines ou plus avant l’apparition de la crise et l’émergence de crises tardives, spontanées et récurrentes permet d’étudier les causes profondes de l’épileptogenèse post-traumatique, de tester l’efficacité des approches préventives et de nouveaux candidats thérapeutiques après l’apparition de la crise, et a le potentiel pour le développement de biomarqueurs de l’épileptogénèse post-traumatique parce qu’environ la moitié des animaux développent une épilepsie post-traumatique.

Le choix du modèle animal pour l’étude de l’épilepsie post-traumatique dépend de la question scientifique, du type de lésions cérébrales étudiées et des outils qui seront utilisés pour déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. En fin de compte, tout modèle d’épilepsie post-traumatique doit démontrer à la fois l’émergence de crises spontanées après TBI et une période de latence initiale dans un sous-ensemble d’animaux TBI, parce que pas tous les patients qui encourent un TBI continuer à développer l’épilepsie. Pour ce faire, l’électroencéphalographie (EEG) avec acquisition vidéo simultanée est utilisée dans ce protocole. Comprendre les aspects techniques qui sous-tendent le matériel et les approches d’acquisition de données est essentiel pour une interprétation précise des données. Les aspects matériels critiques comprennent le type de système d’enregistrement, le type d’électrodes (plomb visousé ou fil) et le matériel dont ils sont faits, l’acquisition vidéo synchronisée (dans le cadre du système EEG ou tiers), et les propriétés du système informatique. Il est impératif de définir les paramètres d’acquisition appropriés dans n’importe quel type de système en fonction de l’objectif de l’étude, des événements d’intérêt de l’EEG, de la méthode d’analyse plus poussée et de la durabilité du stockage des données. Enfin, la méthode de configuration des électrodes (montage) doit être envisagée, car chacune présente des avantages et des inconvénients et affectera l’interprétation des données.

Ce protocole détaille comment utiliser le modèle modifié de chute de poids de Marmarou^10,11 pour induire des dommages diffus ayant pour résultat des saisies spontanées, non provoquées, récurrentes chez les souris, décrit des approches chirurgicales pour acquérir un EEG continu et multicanal simple et multicanal, et l’EEG continu et synchronisé de vidéo utilisant le montage monopolaire, bipolaire, ou mélangé.

Protocol

Toutes les procédures animales décrites dans ce protocole ont été exécutées conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de Virginia Tech et conformément au « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals » des National Institutes of Health. . 1. Protocole de manipulation des animaux REMARQUE : Ce protocole vise à s’habituer aux animaux commandés par un vendeur à l’installation après l’arrivée et à les…

Representative Results

Le protocole décrit ici la méthode d’induction d’une blessure diffuse dans l’isolement (p. ex., en l’absence d’une lésion focale) à l’aide d’un modèle de souris de TBI diffus répétitif(figure 1). La figure 1A représente le dispositif de chute de poids et ses composants (Figure 1A, a1-a5) utilisés pour l’induction de tBI dans ce modèle et des étapes cruciales au cours de la…

Discussion

Contrairement aux modèles de l’ICC et du FPI induisant des lésions focales ou diffuses, le modèle de TBI diffus répétitif décrit dans ce protocole permet l’induction de lésions diffuses en l’absence de lésions cérébrales focales et ne nécessite pas d’ouvertures du cuir chevelu ou crâniennes et de l’inflammation associée. Un avantage supplémentaire de l’absence de craniectomy dans ce modèle est qu’il permet non seulement d’implanter les électrodes pour l’enregistrement continu chronique d…

Materials

0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB